- 1、本文档共3页,可阅读全部内容。
- 2、原创力文档(book118)网站文档一经付费(服务费),不意味着购买了该文档的版权,仅供个人/单位学习、研究之用,不得用于商业用途,未经授权,严禁复制、发行、汇编、翻译或者网络传播等,侵权必究。
- 3、本站所有内容均由合作方或网友上传,本站不对文档的完整性、权威性及其观点立场正确性做任何保证或承诺!文档内容仅供研究参考,付费前请自行鉴别。如您付费,意味着您自己接受本站规则且自行承担风险,本站不退款、不进行额外附加服务;查看《如何避免下载的几个坑》。如果您已付费下载过本站文档,您可以点击 这里二次下载。
- 4、如文档侵犯商业秘密、侵犯著作权、侵犯人身权等,请点击“版权申诉”(推荐),也可以打举报电话:400-050-0827(电话支持时间:9:00-18:30)。
查看更多
焦磷酸测序原理和引物设计
Pyrosequencing RCR
实验原理:焦磷酸测序采用生物素标记的引物进行PCR扩增,将PCR产物纯化并变性为单链后,向其中加入四种酶的混合物:DNA聚合酶(合成DNA双链,释放dNTP的焦磷酸基团,释放出来的焦磷酸基团的量与和模板结合的dNTP的量成正比)、ATP硫酸化酶(在adenosine 5′ phosphosulfate存在的情况下催化焦磷酸基团形成ATP)、荧光素酶(在ATP介导下使荧光素转化为氧化荧光素,氧化荧光素能释放与ATP量成正比的可见光信号)及三磷酸腺苷双磷酸酶(降解未参入新链的dNTP及ATP,猝灭荧光)。
在测序过程中,每次加入一种类型的dNTP,若该dNTP能与模板链互补配对,则在四种酶的作用下发生一系列的反应,最终将荧光信号转换成电信号体现出来,显示为一个个高度不一的峰,峰的高度与碱基的个数成正比。反之,当dNTP不能与模板链结合时,将直接被三磷酸腺苷双磷酸酶降解,相应的将不会显示峰值。如下图所示:
引物设计
焦磷酸测序的模板也是经亚硫酸盐修饰后扩增,故其引物设计原则与BSP引物设计基本一致:1)引物长度在18~24碱基;
避免引物间互补或自身形成发卡结构
引物中G/C – A/T的分配比例相当,使Tm在62-65°C之间
其主要区别在于:1)Pyrosequencing的一条引物的5 端需使用生物素标记,以和磁珠或琼脂糖beads结合,另一条引物不要标记
由于游离的生物素将会和生物素标记的PCR产物竞争结合联霉亲和素(beads)而降低信号水平,须使用HPLC纯化生物素标记的引物。
要确保PCR产物目标量大,且没有非特异性条带,也没有引物二聚体。PCR完成后使用电泳鉴定PCR产物。
PCR循环数须足够,以保证完全消耗掉引物。
Pyrosequencing 的引物设计可以直接使用PyroMark Assay Design 2.0软件进行设计。使用该软件时,只需将目的基因序列输入,该软件便可自动设计反应需要的引物,并会将CpG位点一一罗列出来,与常用的引物设计软件一样,也会有一个评分,建议使用评分在九十分以上的引物,当最高得分仍较低时,可考虑将BSR引物的其中一条进行生物素标记后使用。
PS:PyroMark Assay Design 2.0软件对目的基因的片段长度有限制,建议PCR的目的片段控制在300bp以内,测序片段控制在100bp,这样得到的结果会更加准确可靠。
您可能关注的文档
- 河道治理与水土保持工程(2011年).doc
- 治疗颈椎病特效穴位.doc
- 治愈母亲乳糜尿病过程和感想.doc
- 治疗鸭肠炎特效药.doc
- 泌尿科护理论文急性胰腺炎 论文急性胰腺炎护理论文:非手术治疗急性胰腺炎护理探讨.doc
- 泌尿内科护理论文:非手术治疗急性胰腺炎护理探讨.doc
- 法实施和实现.doc
- 泗阳法院肖文执行难文章.doc
- 法治和公民 2.doc
- 波拉一次成像照片和照相机.doc
- 专卖店促销员销售与成交技巧培训课件(34P).pptx
- 红色商务风新员工入职销售技巧知识培训课件(34P).pptx
- 专卖店商场销售员销售与成交技巧培训课件(34P).pptx
- 小区物业保安法律知识培训课件(28P).pptx
- 专卖店销售员轻松成交技巧培训(34P).pptx
- 轻松成交客户新员工入职通用销售技巧知识培训(34P).pptx
- 2024年初级《银行业法律法规与综合能力》考前必刷必练题库500题(含真题、必会题).docx
- 2024年“新安法知多少”知识竞赛题库及答案(最新版).docx
- 2024年30秒毕业生面试工作自我介绍.docx
- 2024年《医务人员礼仪培训》心得体会.docx
文档评论(0)