叶绿体色素的提取.docx

叶绿体色素的提取、分离、理化性质和含量测定Ⅰ提取与分离实验日期：2011.10.22 实验者：XXX 同组姓名：XXX实验目的：学习应用薄层色谱法分离叶绿体色素的实验方法。了解叶绿素的组成、性质和测定叶绿素有助于理解光合作用的本质。实验原理:叶绿体是进行光合作用的细胞器。叶绿体中的叶绿素a，叶绿素b，胡萝卜素和叶黄素与类囊体膜结合成为色素蛋白复合体。这些色素都不溶于水而溶于有机溶剂，故可用乙醇等有机溶剂提取。提取液可用薄层色谱法加以分离和鉴别。植物活性成分的分离常用薄层层析法和柱层析法，其中柱层析适用于大量制备。本实验采用薄层层析色谱法，其中固定相用硅胶预制板。实验材料与试剂:新鲜的菠菜叶片。体积分数为95%的乙醇，碳酸钙粉末，展开剂。研钵，漏斗，滤纸，三角瓶，剪刀，点样毛细管，层析缸，硅胶预制板。实验步骤:色素提取液的制备取新鲜叶片4~5片，洗净，擦干叶表面，去除中脉剪碎（越碎越好），放入研钵中。向研钵中加入少量CaCO3，加2~3ml体积分数为95%的乙醇，研磨至糊状，再加10~15ml体积分数为95%的乙醇，上清液用漏斗过滤出，残渣再用10ml体积分数为95%的乙醇冲洗一次，一同过滤于三角瓶中，即制成叶绿体色素提取液。提取液应尽量避光保存。因提取量较大，可用于其他相关实验（即用于后面的理化性质的验证）。叶绿体色素的分离取硅胶预制板一个，用点样毛细管吸取上述提取液，平行于硅胶板的短边，距下边缘1cm处用毛细管划线，自然风干后划第二次，重复操作3~4次，确保划的滤液细线颜色足够深，使分离结果更加明显。取已经加入适量展开剂的层析缸，把硅胶预制板带有色素的一端放入，使其下端浸入展开剂中，但注意液面不可超出滤液细线。迅速改好层析缸盖减少展开剂的挥发对人体产生的不良影响。注意观察展开剂的扩散过程，当各种色素得到较好分离，且展开剂前沿接近硅胶预制板上端边缘处时，取出硅胶预制板迅速用铅笔标出展开剂前沿和各色素带的位置。注意要迅速，否则展开剂前沿很快会挥发消失，且前沿和各个色素带的位置均会有微小变动。测量出前沿和各个色素带距离原点的距离并记录。实验结果与分析（以图辅助以文字展示）:.自上而下分别为：胡萝卜素，叶绿素a，叶绿素b，叶黄素。各自到原点的距离：展开剂前沿：8.50cm胡萝卜素：8.10cm ，Rf=0.95叶绿素a：6.70cm ，Rf=0.79叶绿素b：6.30cm ，Rf=0.74叶黄素：5.90cm ，Rf=0.69事实上实验中不止看到了这四种色素带，在它们下面还有一些分离出来的色素带，但是不在本实验的讨论范围中，故不予考虑。Ⅱ理化性质实验目的：验证叶绿体素的理化性质。实验原理：叶绿素可与碱起皂化反应产生的盐能溶于水中，因此可用此法分离叶绿素和类胡萝卜素。叶绿素吸收光子而转变成激发态，激发态的叶绿素分子很不稳定，当它变回基态时可发射出红光量子因而产生荧光。叶绿素的化学性质很不稳定，易受强光的破坏，特别是当叶绿素与蛋白质分离后，而类胡萝卜素则较稳定。叶绿素中的镁可以被H+取代而成褐色的去镁叶绿素。去镁叶绿素遇铜成为铜代叶绿素，铜代叶绿素很稳定，在光下不易被破坏，故常用此法制作绿色多汁植物的浸渍标本。实验材料与试剂：新鲜菠菜叶片。叶绿素提取与分离实验中剩余的叶绿素提取液。小试管，试管架，水浴锅（60℃和90℃各一个），10ml移液管，洗耳球，三角瓶。体积分数为95%的乙醇，笨，醋酸铜粉末，质量分数为5%的稀盐酸，醋酸-醋酸铜溶液，氢氧化钾-甲醇溶液。实验步骤：光对叶绿素的破坏作用取2支小试管，各加入2.5ml叶绿体色素乙醇提取液，并用乙醇稀释一倍。其中一支放在直射阳光下，另一只用锡纸包严，40min后对比观察颜色有何变化。皂化作用（绿色素与黄色素的分离）取1支小试管加入3ml浓的叶绿素乙醇提取液，加入1ml氢氧化钾-甲醇溶液，充分摇匀。片刻后，加入3ml苯，摇匀，再沿试管壁慢慢加入1ml左右蒸馏水，轻轻混匀（勿激烈摇荡），然后置于试管架上静置分层。若溶液不分层，则用滴管吸取蒸馏水，沿管壁滴加，边滴加边摇动，直到溶液开始分层时静置。H+和Cu2+对叶绿素分子中Mg2+的取代作用取2支试管，第一支加叶绿体色素提取液5ml，作为对照。第二支试管加叶绿体色素提取液5ml后，再加入质量分数为5%的稀盐酸数滴，摇匀，观察溶液颜色变化情况。当溶液变褐后，再加入少量醋酸铜粉末，60℃水浴加热，观察溶液颜色变化情况，并与对照试管相比较。取新鲜菠菜叶片两小片（能塞进小试管即可），放入试管中，加醋酸-醋酸铜溶液，使之没过叶片，90℃水浴加热，随时观察叶片颜色的变化，直至颜色不再变化为止。荧光现象的观察实验前取一支小试管加入3ml浓的叶绿体色素乙醇提取液，在直射光下照射，比较溶液的透射光与反射光颜色有何不同。实验结果与分析（