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丹参素对低氧低糖损伤神经细胞影响 　 作者：孙超，甘露，张梅，郑秋生，刘婷，王振华 【摘要】 目的评价丹参素对低氧低糖诱导人拟神经元细胞SH-SY5Y损伤的影响。方法采用细胞培养于人工无糖培养基、1.5% O2和5% CO2环境建立低氧低糖损伤SH-SY5Y细胞模型。以SRB方法测定存活细胞数，相差和荧光显微镜观察细胞凋亡，采用细胞培养上清乳酸脱氢酶(LDH)活性反映细胞受损伤程度，并测定了细胞内脂质过氧化产物丙二醛(MDA)水平和超氧化物歧化酶(SOD)活性以反映细胞氧化胁迫状态。结果低氧低糖损伤24 h，存活细胞数量明显减少，SH-SY5Y细胞皱缩、吖啶橙和溴化乙啶双染可见明显核皱缩、碎裂及凋亡小体出现，细胞培养上清LDH水平明显升高，细胞内MDA含量明显升高，SOD水平降低，表明细胞受到严重的氧化胁迫损伤。丹参素可抑制细胞内SOD活性的降低，对上述各损伤指标均有明显的干预作用，且具有浓度依赖性。结论丹参素对低氧低糖所致SH-SY5Y神经瘤细胞损伤有明显保护作用，有望成为有临床应用价值的神经保护剂。 【关键词】 丹参素; 低氧低糖损伤; 神经保护; 氧化胁迫 神经细胞凋亡在脑缺血缺氧性损伤所致神经功能丧失过程中起着至关重要的作用，一些药物可通过干预神经细胞凋亡过程阻止缺血性损伤的进一步发展，而发挥对缺血性脑病的治疗作用。在脑缺血性损伤机制中，自由基链锁反应被认为是造成脑组织损害的重要机制之一，缺血后再灌注可促发自由基的链锁反应，加剧神经元凋亡和坏死，加重脑组织缺血性损伤[1]。因此，清除自由基、切断自由基对脑缺血的继发性损害成为目前神经保护治疗的重要靶点之一，依达拉奉作为自由基清除剂的临床成功应用也证明了这一点[2]。丹参作为中药典型的活血化瘀药，被广泛用于治疗缺血性心脑血管疾病。丹参素(danshensu)是丹参的有效活性成分，具有抗缺血缺氧、抗自由基、抑制细胞内Ca2+升高等作用[3]。张文生等[4～6]采用连二亚硫酸钠阻断呼吸链模拟低氧环境，证明丹参素对神经细胞低氧低糖损伤具有保护作用，但化学性低氧难以反映缺血性脑卒中的真实病理状态。本研究以具神经元特征的人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞，利用三气培养箱建立物理低氧低糖损伤模型，观察丹参素对神经细胞损伤作用的影响，并从氧化胁迫角度探讨其保护机制，比化学损伤更贴近于机体内环境。 　　1 材料 　　SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞系由江苏省原子医学研究所卫生部核医学重点实验室谈成老师惠赠;丹参素由山东烟台靶点药物研究所提供，纯度99.8%;依达拉奉注射液为南京先声东元制药有限公司产品;超氧化物歧化酶(SOD)测试盒，丙二醛(MDA)测试盒，乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒和考马斯亮蓝法蛋白浓度测试盒均为南京建成生工程研究所产品;磺酰罗丹明B(Sulforhodamine B，SRB)、吖啶橙(Acridine Orange，AO)、溴化乙啶(EB)均为SIGMA公司产品;MEM培养基为GIBCO公司产品;特级胎牛血清为杭州四季青生物工程公司生产;其余试剂均为国产分析纯。 　　2 方法 　　2.1 细胞培养和低氧低糖损伤模型的建立SH-SY5Y细胞用含10%胎牛血清、100 U·ml-1青霉素、100 mg·L-1链霉素的MEM培养基，于37℃、5% CO2条件下培养。低氧低糖时，细胞用不含葡萄糖、含10%胎牛血清的Earle’s balanced salt solution (BSSo)( mmol·L-1) ( NaCl 116，KCl 5.4，MgSO4 0.8， NaH2PO4 1.0，CaCl2 1.8，NaHCO3 26)，培养于37 ℃，1.5% O2，5%，CO2和94.5% N2的三气培养箱(Thermo Forma 3111)。 　　2.2 SRB法测定存活细胞 SRB可使细胞蛋白染色，间接反映活细胞数量[7]。 　　将1×105细胞悬液100 μl接种于96孔板内，正常培养24 h待细胞完全贴壁，分别加入终浓度为20，10，5，2.5，1.25，0.625 μg·ml-1的丹参素处理，置于另设正常培养对照和依达拉奉(100 μmol·L-1)作为阳性对照，每处理设3个平行孔。24 h后，轻轻吸去培养液(以测定LDH)，细胞以20%三氯醋酸4℃固定1 h，自来水冲洗5次后晾干，以0.4% (W/V) SRB(溶解于1%醋酸水溶液)染色30 min，以1% 醋酸冲洗4次，以洗掉未结合的染料，以10 mmol·L-1Tris碱溶液(pH 10)溶解结合的染料，用多功能酶标仪(Thermo 3001 VARIOSKAN FLASH)于492 nm波长下测定各孔吸光度。以未处理对照组细胞作为100%，计算各处理组细胞相对存活率。 　　存活率(%)=处理组A未处理组A×