基因工程-7-外源基因的表达.ppt

第六章 外源基因的表达 第一节 外源基因表达的机制 外源基因的起始转录 mRNA的延伸与稳定 外源基因mRNA的有效翻译 表达蛋白在细胞中的稳定性 4.1 Lac和Tac表达系统 4.2 PL和PR表达系统 4.3 T7表达系统 5. 形成包涵体的原因 基因工程菌的表达产率过高 重组蛋白的氨基酸组成 重组蛋白所处的温度与pH值 重组蛋白是大肠杆菌的异源蛋白 6.包涵体纯化 7. 包涵体复性方法 稀释复性 透析复性 超滤复性 柱上复性 2.融合表达的亲和纯化蛋白标签 个子越小越好 生理条件下带电越少越好 容易得到和天然蛋白相似的产物 融合标签的免疫原性越少越好 融合产物不必除去标签可直接作为抗原免疫 2.1 His蛋白标签 2.2 His蛋白标签类型 N末端加入标签 C末端加入标签 顺式抑制载体 多系统表达载体 含有双标签载体 2.3 GST融合表达系统 2.4 pGEX表达融合蛋白的优越性 载体构建无需考虑SD及RBS序列 由于载体自带LacI基因，对宿主无选择性 蛋白纯化条件温和，有利于保持蛋白活性 GST蛋白与目的蛋白分离简便 2008年度诺贝尔化学奖 5、聚丙烯酰胺凝胶电泳 polyacrylamide gel electrophoresis, PAGE β-半乳糖苷酶 ；乳酸菌；沙克乳杆菌细菌素 Figure 1. Schematic overview of the pEH plasmids used in this study.256rep: replication determinants; lacLM: structural gene; erythromycin resistance marker (ermB), histidine kinase (sppK), and response regulator (sppR) genes; inducible PsppA promoter for pEH3, and PsppQ promoter for pEH9; lollypop structures, transcriptional terminator. pEH3R pEH9R pEH3P pEH9P L. plantarum L. sakei pEH3R pEH9R pEH3P pEH9P 大肠杆菌基因表达载体一般是质粒表达载体，含有能在大肠杆菌中有效复制的复制子。 载图：吴乃虎《基因工程原理》（下册）p117或杨汝德《基因工程》p149 *参考杨汝德《基因工程》p148 *参考杨汝德《基因工程》p154 参考杨汝德《基因工程》p148 PL和 PR启动子是大肠杆菌λ噬菌体中控制早期转录的启动子。选择可调控的启动子和相关的调控序列，是构建一个表达系统首先要考虑的问题。 王关林《植物基因工程》p591 P395 SDS——十二烷基硫酸钠。 参考张维铭《现代分子生物学实验手册》p122它是分子生物学实验中很常用的一种技术，适用于分离低分子质量蛋白质、小于1kb DNA片段及DNA序列分析。 p343为与核糖体16S rRNA互补结合的位点，该序列至少含有AGGAGG序列中的4个碱基; SD序列与翻译起始密码子之间的距离为3～9个碱基。 周质（periplasm）：是指在大肠杆菌一类革兰氏阴性细菌中，位于内膜和外膜之间的细胞结构部分。表达形式：不溶性蛋白和可溶性蛋白两种。 由于脂体及部分破碎的细胞膜及膜蛋白与包涵体粘连在一起，在溶解包涵体之前要先洗涤包涵体，在50mM Tris，pH7.0-8.5,1mMEDTA中其中尿素的增溶效果差，异氰硫酸胍最强。 （二）酵母基因表达载体 酵母基因表达系统的载体一般是一种穿梭质粒，能在酵母菌和大肠杆菌中进行复制。 1. DNA复制起始区 在大肠杆菌中复制的复制起始序列 在酵母菌中引导进行自主复制的序列 2. 选择标记 营养缺陷型选择标记：它与宿主的基因型有关。 3. 有丝分裂稳定区 4. 表达盒 表达盒由启动子、分泌信号序列和终止子等组成，是酵母表达载体的重要元件。 第三节 外源基因表达产物的检测 外源基因表达产物检测的过程就是对特异性mRNA或蛋白质的检测。 检测特异性mRNA的方法 Northern杂交法 检测特异性蛋白质的方法 报告基因的酶法检测 免疫学检测法 生物学活性检测法 定量RT-PCR法 一、外源基因转录产物的检测 1. 定量RT-PCR技术 可以检测外源基因是否转录出mRNA及mRNA表达水平 PCR 产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系 一、外源基因转录产物的检测 1. 定量RT-PCR技术 1.1 荧光染料和荧光探针 1.1.1 SYBR Green