药敏试验方法简介.ppt

用无菌棉拭子蘸取菌液，在试管内壁旋转挤去多余菌液，然后在MH琼脂表面均匀涂布接种3次，每次旋转平板60度，最后沿平板内缘涂抹1周； 平板在室温下干燥3～5min，用无菌镊子或商品化的纸片分配器将含药纸片紧贴于琼脂表面； 35℃孵育16～24小时，量取抑菌圈直径； 根据抑菌环的直径，按照CLSI标准判读，报告敏感、中介、耐药。 * * CLSI对K-B法的标准化规定 纸片药物含量、细菌接种浓度、培养基、平皿厚度、孵育时间、环境、判定标准、质控方法等；常规测试、报告的抗生素。 不同的药判定标准不同；不同的菌判定标准也不同。 * 扩散法药敏影响因素 培养基 pH值7.2-7.4 营养程度（肠球菌能生长） 厚度 抗生素拮抗剂含量（用29212监控） 钙镁离子含量、锌离子含量（用27853氨基糖苷类和亚胺配能结果监控） 菌悬液 浓度高抑菌环缩小（假耐药） 浓度低则扩大（假敏感） 细菌纯度 气体环境 普通细菌放CO2时由于碳酸的影响，药物活性受到影响，形成假敏感或假耐药 苛养菌放普通环境生长不良，导致假敏感 培养时间 粘液性铜绿需48小时 测量方法 稀释法 以一定浓度的抗菌药物与含有受试菌的培养基进行一系列不同倍数稀释（通常为双倍稀释），培养16～24h后，通过观察细菌生长现象来测得药物对受试菌的最低抑菌浓度（MIC）。 * 稀释法（MIC法） MIC法：分为常量法和微量法 常量法：肉汤稀释法、琼脂稀释法 微量法：微量肉汤稀释法 简化双浓度折点法 ATB药敏 简化常规浓度分布MIC法 BD、德灵药敏 动力学计算MIC法 VITEK32、VITEK2药敏 肉汤稀释法 不生长 = 抗生素抑制细菌生长 生长 = 抗生素无法抑制细菌生长 MIC (最小抑菌浓度) = 抗生素可抑制细菌生长的最小浓度。 .25 0.5 1 2 4 8 16 32 MIC = 8 Increasing Antibiotic Conc. 常量稀释法 药敏试验的参考方法： 将标准接种物加入含対倍稀释抗生素的MH肉汤管中. 过夜培养. MIC 即是能抑制细菌生长的含最低抗生素的浓度的那一管所标示的浓度值(琼脂稀释法是将対倍稀释后的抗生素加入融化后平衡到50℃的MHA中再倾制平皿，接种物为一定大小的斑点，浓度也为104CFU/ml). 解释标准(S or R) 是建立在体内可达到的抗生素浓度水平上 104 cfu/ml 4 2 1 0.5 0.25 0.12 0 mg/ml 微量肉汤稀释法 接种后应充分混匀，但不能有气泡产生 静置培养 培养温度；35℃ 气体环境：所有细菌（包括苛养菌）均置大气环境；厌氧菌置厌氧环境；微需氧菌置微需氧环境；淋菌琼脂稀释法置CO2 培养时间：18小时 药敏结果报告可用MIC（μg/ml）或对照CLSI标准用S、R和I报告。 对于稀释法的批量试验，有时需要报告MIC50、MIC90。 * 稀释法药敏影响因素 培养基 pH值 7.2-7.4 营养程度 抗生素拮抗剂含量 钙镁离子含量（钙10-25；镁10-12.5μg/ml） 菌悬液（5×104CFU/ml） 接种效应 浓度高MIC抬高 浓度低MIC压低 细菌纯度 气体环境 所有需氧细菌均放普通大气环境。如果放CO2，由于碳酸的影响，药物活性受到影响，形成假敏感或假耐药 培养时间 真菌需48小时 奴卡菌需5天 E-test法 将稀释法和扩散法的原理结合起来，直接测定药物对受试菌的MIC 。 * MIC 值标注于试条的光面 Etest 试条 毛面贴于MHA上 Etest 操作程序 按照扩散法标准操作涂布接种 贴上试条并培养15-18小时 读取抑菌浓度并按标准解释 细菌生长区 E试条 细菌生长抑制区 256 128 8 0.16 判读MIC *  肺炎链球菌青霉素 MIC = 3 ?g/ml 结果读取 BD PhoenixTM -100 凤凰全自动细菌鉴定/药敏检测系统 最大的标本容量：对100个标本同时进行鉴定与药敏测试！ 鉴定部分： 51孔鉴定实验 改良经典实验 显色＋荧光检测 无需附加实验与试剂 药敏部分： 85孔药敏实验 比浊＋氧化还原（专利） 实测倍比稀释MIC值 药物种类与浓度梯度最多 耐药机制检测同步进行 封闭式设计，安全无泄漏 先进的鉴定/药敏复合板设计 PhoenixTM100鉴定板革兰氏阳性板、革兰氏阴性板生化反应组合 革兰氏阳性菌鉴定板 革兰氏阴性菌鉴定板 鉴定部分： 51孔鉴定实验,改良经典实验 显色＋荧光检测,无需附加实验与试剂 鉴定实验方法 在研究了上百种反应底物基础上，选择了45种反应底物。 检测板每20分钟检测一次 Green, blue and red 检测显色反应 U