奶牛γ干扰素基因的克隆及其在COS1细胞中的表达研究.pdf

中国畜牧兽医学会家畜传染病学分会成立20周年庆典暨第十次学术研讨会论文集 奶牛Y一干扰素基因的克隆及其在COS-1细胞中的表达 许金俊，秦爱建’，金文杰，刘岳龙 5009) (扬州大学畜牧兽医学院动物医学系，江苏扬州，22 毒性T细胞产生的能力等诸多免疫调节活性，可单独作为生物制剂应用于一些疾病的防治，又可作为免疫 佐剂，增强疫苗的免疫效果，还可与一些病原微生物的保护性抗原基因共表达。从而加强和改善疫苗的免 疫效果。1986年Cerretti 白。 了坚实的基础。 1材料与方法 1．1材料 I．1．1试验动物：健康初生犊牛，由扬州大学实验农牧场提供。 1．1．2质粒、宿主细菌、细胞及病毒：大肠杆菌TGl由本室保存；克隆用Vector (大连)生物工程公司；表达用载体pcDNA3．I／zeo 1．i．3主要试剂：DMEM培养基、T尉ZOL 产品；PHA为上海医学检验中心产品；淋巴细胞分层液为上海华精生物科技公司产品；AMV反转录酶、 经180℃干烤8h以上。 1．2方法 基金项目：扛苏省“333”工程人才培养基金资助 中国畜牧兽医学会家畜传染病学分会成立20周年庆典暨第十次学术研讨会论文集 号肽的整个ORF，引物由宝(大连)生物工程公司合成。 为2．5x106／ml，加入50m 胶电泳观察其完整性，其余置于一70℃保存备用。 5×AMVBuffer、10mM 后冷却到O℃，依次加入9．却l水、卑l 录酶1u1，于42℃反转录60min，95℃5min灭活反转录酶。 PCR扩增：在PCR管中依次加入水3舢1、10xPCR 5 min_55℃imin--+72℃1．5min min，然后94℃1 30个循环，72℃7min，4℃10rain，反应结束 后取5¨1产物琼脂糖凝胶电泳分析。 1_2．4 盒进行回收，按常规与PMDl8一T BovIFNyeDNA编码区第375bp处和PMDl8一T 点的特点用Pstl单酶切鉴定插入片段的方向，阳性重组质粒送宝(大连)生物工程公司进行测序。 公司脂质体转染程序进行转染，简要步骤如下：取A、B两个指形管，各加10m1无血清DMEM培养液， 段的空载体pcDNA3．1的转染过程同上。 正常ICR血清代替鼠抗rBovIFN—Y高免血清为一抗三个阴性对照。 1．2．7 单层加入倍比维持液稀释的细胞培养上清，每个稀释度两孔，于37℃作用24小时，吸去上清，每孔接种 中国畜牧兽医学会家畜传染病学分会成立20周年庆典暨第十次学术研讨会论文集 观察各孔细胞病变，以能抑制50％细胞病变的样品的最高稀释度定义为1单位干扰素。 2结果 2．IRT—PCR扩增BovIFNy结果：利用TRIZOLReagent提取的脾淋巴细胞总RNA 淋巴细胞总RNA中扩增出了540bp特异性片段，片段大小与预期结果相符。 2．2 与Cerretti相比具98．2％的同源性。 2．3 2．5 中检测不到干扰素效价。这一结果证实，rBovIFN—Y可以分泌到细胞外，并具有一定的生物学活性。 3小结与讨论 码区基因，通过不同酶切特gⅡ是该基因内部存在的酶切位点酶切证实了该基因片段正确，测序和体外表达 结果也进一步证实了该基因正确。在克隆时我们曾多次采用一步法，但均未成功，后来我们采用两步法， 出了特异性片段，这对于其它细胞因子和其它基因的的体外扩增也是一个很好的借鉴。 3．2 NK细胞，维持CTL和B细胞的增殖分化，增强MHC 用于奶牛疾病如乳房炎的预防控制，也可以作为免疫佐剂增强疫苗如乳房炎疫苗的免疫效果，利用基因工 中国畜牧兽医学会家畜传染病学分会成立20周年庆典暨第十次学术研讨会论文集 自，并进行了一些临床应用试验。与天然干扰素和真核表达产物相比，原核表达产物由于不能正确进行装 配、磷酸化和糖基化，其生物学活性不可避免的将受到不同程度的影响，而且大肠杆菌的表达产物易形成包 涵体，纯化复性步骤烦琐，内毒素难以去除，其临床应用往往受到一定的限制，而真核表达系统由于其表 达产物的天然性、无毒性和易于纯化越来越得到重视，国外学者也已经对酵母系统、疱疹病毒载体、杆状