水稻基因组DNA提取，PCR，纯化分子生物学实验报告.pdf

分子生物学实验报告 实验内容：设计一个完整的实验，以水稻基因 组为例，最终得到纯化的一个基因片段。 1 / 10 水稻基因组DNA 提取以及基因片段的扩增、纯化和检测 1.实验目的： 1.1 熟练掌握实验室分子生物学相关的仪器的规范使用方法 1.2 遵守实验室相关的实验规章制度，服从实验人员的管理 1.3 熟练掌握实验室有关植物基因组DNA 的简单提取方法以及检测方法 1.4 了解琼脂糖凝胶电泳的原理，掌握胶体制备的方法以及电泳仪的操作方 法 1.5 掌握PCR 技术的操作流程，熟练使用PCR 仪并了解其工作原理及检测方 法 1.6 了解柱纯化的原理及使用方法 2.实验原理 1）水稻叶片基因组DNA 提取 水稻属于真核生物，其 DNA 以双链线性高分子形式存在于细胞核中，一般 以染色质形式在。由于植物组细胞破裂之后，DNA 酶会水解DNA 因此在提取过 程总要加入EDTA 螯合剂从而抑制DNA 酶活性。 水稻叶片基因组 DNA 的提取主要是通过破碎组织和细胞从而通过对细胞内 其他杂质的去处来达到基因组DNA 的提纯。提纯的产物通过1%的琼脂糖凝胶电 泳进行检验。 本实验是通过CTAB 法来进行提取的，它是一种阳离子表面活性剂，能溶解 细胞膜和和核膜蛋白，使核蛋白解聚从而使DNA 游离出来，已达到分离的目的。 2）特定基因片段的PCR 扩增 PCR(Polymerase Chain Reaction,聚合酶链反应)是一种选择性体外扩增DNA 或 RNA 的方法。它包括三个基本步骤: (1) 变性(Denature): 目的双链DNA 片段在95℃ 2 / 10 下解链;(2)退火(Anneal):两种寡核苷酸引物在适当温度(55℃左右)下与模板上的 目的序列通过氢键配对;(3) 延伸(Extension):在 TaqDNA 聚合酶合成 DNA 的最适 温度下, 以目的 DNA 为模板进行合成. 由这三个基本步骤组成一轮循环,理论上每 一轮循环将使目的 DNA 扩增一倍,这些经合成产生的 DNA 又可作为下一轮循环 的模板,所以经30 轮循环就可使DNA 扩增上百倍。 3）PCR 产物的纯化 PCR 产物的纯化在本实验中是通过柱纯化的方法进行的。试剂盒吸附柱中的 硅胶膜可以再高盐度的缓冲液下结合DNA，在通过低盐度的缓冲液洗脱，通过这 样的纯化过程去除了除特定产物外的其他DNA 样品以及各种杂质。 4 ）DNA 的琼脂糖凝胶电泳检测 琼脂糖凝胶电泳是利用 DNA 分子在泳动时的电荷效应和分子筛效应来达到 混合物分离的目的。DNA 分子的迁移速率与其相对分子质量成反比，此外不同构 型的DNA 分子的迁移速率不同（cccDNA> ｌDNA>ocDNA)。通过EB 染色即可在紫 外灯下观察到胶体中DNA 的纯度、大小等情况。 3.实验试剂和实验仪器 1）实验试剂 CTAB 提取液、苯酚/ 氯仿/ 异戊醇（25:24:1)、氯仿/ 异戊醇(24:1)、EDTA、异 丙醇、70% 乙醇；Taq 酶、PCR Buffer、引物、dNTP、ddH2O ；PB、PW、EB （Elution Buffer）；西班牙琼脂糖、TAE 、EB （溴化乙锭）溴酚黄、Marker。 2）实验仪器 移液器一套、离心管架、电子天平、水浴锅、微波炉、高速离心机、电泳系 列设备、研钵、紫外透射仪、PCR 仪、漩涡振荡器、掌上离心机、 3 / 10 3）实验耗材 配套的不同规格枪头、不同规格离心管、吸附柱、乳胶手套、PE 手套以及 鞋套。 4.实验步骤 1）水稻