010HIV筛选试验原理_.ppt

HIV筛选试验的原理、方法、应用及其质量保证湖南省临床检验中心 吕岳峰;;一、献血者HIV筛选;2、献血者HIV筛选的意义 ①防止HIV的传播 ②防止其它传染病原体的传播 ③节约人力、财力 ;二、试验原理 ; 在选择最恰当的方法使用时，需考虑的一些特性： ※试验的原理 ※复杂性 ※反应时间 ※敏感性 ※特异性 ※不同情况下的适用性 ※有效性 ※费 用; 这三种试验都基于相同的生物学原理，并包含相同的两大基本步骤： 1、样品中特异性抗原或抗体的存在是通过其与包被的抗体或抗原结合，形成抗原抗体免疫复合物而完成标准的免疫学反应来证明的。 2、免疫复合物形成后由指示系统来检测。 ;●术语：;三、酶标免疫技术EIA(ELISA); 根据固相抗原的不同来源试剂盒分四代：第一代使用的是纯化的或未经纯化的天然病毒或是被病毒感染细胞培养后的细胞溶解产物。第二代使用重组抗原，它通过将病毒核酸片段整合到酵母菌内，经基因工程使该酵母菌大量扩增，再纯化病毒蛋白质等步骤获得。第三代使用通过化学合成法人工合成的病毒多肽。 目前已有第四代试剂盒,它是在第三代试剂盒的基础上增加了P24抗体,故能同时检测HIV抗原和抗体.; 这里介绍两种反应原理相同，但抗原包被的方法不同的EIA ： 1、包被微孔（聚苯乙烯），即通常所见的96孔板,简称微孔法。 2、包被小珠（聚苯乙烯小珠），小珠直径约4mm：即通常所见的20/60孔Abbott小珠,简称珠法。 ;下面先介绍微孔法：; ※竞争型EIA：这一方法稍微复杂些，标本中可能存在的天然抗体与酶标记的特异抗体竞争固相抗原上的结合位点。 ※夹心型EIA：这是一种高特异性的EIA法，标本中的病毒抗体与固相抗原结合，然后通过结合的酶标记抗原被检测。 ; 第一种：抗球蛋白型EIA方法学(HIV抗体筛选) 1、包被：抗原吸附于微孔板表面形成固相抗原的过程(见图12); 各孔中加入含抗原的碳酸氢盐缓冲液，放4℃孵育12-16小时，因制造微孔板的塑料能够结合蛋白质，便完成包被。孵育后，弃去抗原溶液，用蒸馏水或特殊性缓冲液洗涤，并使之??速干燥。保存在4℃，放置很长时间也不会有抗原丢失。通常这些板由生产商包被和标化后提供。; 2、加样和孵育：血清或稀释后血清加入孔中，或者血清加入已包含稀释液的孔中，它们在限定的时间和准确的温度下温育，温育时间可以30分钟至2小时，温度可以18-45℃。每块板上设一定数量的阳性和阴性对照孔，以及低值阳性对照。在这段时间内，测试血清中存在的特异性抗体与病毒抗原结合。(见图13);图13; 3、洗板：洗去孔内的游离血清(见图14);4、加酶标记物和孵育(见图15）;图16;6、显色 (见图17); 7、加稀酸溶液终止反应。 8、读取微孔中溶液的吸光度（光密度）值（OD值），并判断试验的结果。 ; 第二种：竞争型EIA方法学（HIV抗体筛选） 竞争型EIA的基本原理与抗球蛋白型EIA相同：HIV抗体与固相抗原结合，然后检测出标本中存在的抗体。 ;但竞争型EIA与抗人球蛋白型EIA在抗体的检测方法上略有不同，加待测血清到已包被抗原的微孔，同时加入酶结合物，样品和酶结合物同时孵育。酶结合物是酶标HIV抗体，而不是酶标非特异性抗人IgG抗体。酶标HIV抗体与标本中的HIV抗体竞争抗原的结合位点。酶标抗体浓度水平被设定为低于标本中的HIV抗体最小浓度以保证后者优于酶标HIV抗体而与抗原结合。 ; 下面是基本的检测步骤： 1、抗原包被于微孔表面上（见下图）。 ;2、加入血清、加入酶结合物，孵育(见图18)。; 3、孵育结束，洗去游离的血清和酶结合物。(见图19); 4、各孔中迅速加入底物溶液，在规定的温度(通常18-25℃)、时间条件下孵育。(见图20) ; 5、孵育结束，加入稀酸溶液终止反应。 6、读取孔内溶液OD值，判断实验结果。 不存在HIV抗体的测试样品中，酶标抗体被结合，酶激活底物使之显色。存在HIV抗体的测试样品中，HIV抗体的存在阻止了酶标抗体的结合，这样酶就很少甚至不存在。所以只有很少甚至无底物激活和颜色产生。 ; 第三种：夹心型EIA方法学（筛选HIV抗体）