实验七 维生素的测定（VB2、VC）.ppt

实验七 维生素的测定（VB2、VC） 一、负荷尿中核黄素的测定（荧光分光光度法） 尿中核黄素排出量测定是评价人体核黄素营养状况的一种方法，包括负荷试验和核黄素肌酐比值测定。要求掌握尿负荷实验及尿中核黄素的荧光测定方法。 （一）原理 　　含有核黄素的溶液在紫外线下发黄绿色荧光，在稀溶液中荧光强度与核黄素浓度成正比。核黄素又可被低亚硫酸钠还原而失去荧光，故测定还原前后的荧光强度可去除干扰性荧光物质的影响。 （二）仪器 　　　荧光光度计、 　　　分析天平、 　　　容量瓶、 　　　1 000 ml量杯、 　　　刻度试管 （三）试剂 1. 酸性水 取浓硫酸0.3 ml，加蒸馏水至200 ml。 2. 核黄素标准储备液 精密称取25 mg核黄素于1 000 ml容量瓶中，用酸性水稀释至刻度，移至棕色瓶内，冷藏备用。 3. 核黄素标准应用液 吸取上液4 ml，用酸性水稀释至100 ml。临用时配制。 4. 低亚硫酸钠（Na2S2O4）。 （四）操作步骤 1.样品 受试者于清晨口服核黄素5 mg，收集4 h内的尿液于量杯中，记尿液总量（ml），并将尿样置于暗处备用。取尿样1 ml加酸性水19 ml于一具塞试管内，混匀，在激发波长420 nm和发射波长530 nm处测定荧光强度。记下读数（A）后，取10 mg低亚硫酸钠直接加人比色杯内，摇匀，立即测定荧光强度并读数（B）。 （四）操作步骤 2.内标准 取尿样1.0 ml加核黄素标准应用液1.5 ml，加酸性水17.5 ml，混匀，在同样情况下测定荧光强度，记下读数（C），取10 mg低亚硫酸钠直接加入比色杯内，摇匀，立即测定荧光强度并读数（D）。 （五）结果计算 （六）注意事项 二、食物中还原型维生素C的测定（2,6-二氯酚靛酚滴定法） （一）原理 　　用标准碘酸钾溶液标定抗坏血酸溶液，用已标定的抗坏血酸溶液标定2,6-二氯酚靛酚染料溶液，再用此染料滴定样品中的抗坏血酸。2,6-二氯酚靛酚在酸性溶液中呈红色，被抗坏血酸还原后即失去红色，当溶液中过量一滴染料时即现红色，以示终点。在无杂质干扰时，溶液所用染料量与样品中抗坏血酸含量成正比。 （二）仪器 1. 组织捣碎机。 2. 5.0 ml微量滴定管。 3. 100 ml容量瓶。 4. 50 ml具塞量筒。 （三）试剂 1. 1%草酸溶液、2%草酸溶液。 2. 白陶土。 3. 0.1N碘酸钾标准储备液 精确称取碘酸钾0.3567 g用蒸馏水溶解于100 ml容量瓶中并定容至刻度。 4. 0.001N碘酸钾标准应用液 吸取0.1N碘酸钾标准储备液1.0 ml于100 ml容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度，此溶液1.0 ml相当于抗坏血酸0.088 mg。 （三）试剂 5. 1%淀粉溶液 称取可溶性淀粉0.5 g，溶解在10 m1水中，再慢慢倒入40 m1沸水中，调匀，冷藏。 6. 6%碘化钾溶液 称取纯碘化钾0.6 g，溶解在10 ml水中。用时现配。 7. 抗坏血酸溶液 称取纯抗坏血酸20 mg，用1%草酸溶解于100 ml容量瓶中并稀释 至刻度（200 μg／ml）摇匀。再取其中5 ml稀释至50 ml（20 μg／m1）。 （三）试剂 8. 碳酸氢钠溶液 取碳酸氢钠52 mg溶解在200 ml水中。 9. 2,6-二氯酚靛酚溶液 称取2,6-二氯酚靛酚50 mg，溶解于煮沸的碳酸氢钠溶液中，冷却后置冰箱中过夜，次日过滤于250 ml容量瓶中用水稀释至刻度，摇匀。放棕色瓶中冷藏。 （四）操作步骤 1. 2,6-二氯酚靛酚溶液的标定。 （1）抗坏血酸标准溶液的标定：吸取抗坏血酸溶液（20 μg／ml）5.0 ml于锥形瓶中，加入6%碘化钾溶液0.5 ml，1%淀粉溶液3滴，再以0.00l M碘酸钾标准溶液滴定，终点为蓝色。 （四）操作步骤 （2）2,6-二氯酚靛酚溶液的标定：取已标定的抗坏血酸溶液5.0 ml，1%草酸溶液5.0 ml于锥形瓶中，摇匀，用欲标定的2,6-二氯酚靛酚溶液滴定至溶液呈淡红色，15秒钟不褪色为止。 （四）操作步骤 2. 样品测定 （1）样品处理 取样品100 g剪碎置捣碎机中按1:1（w／v）加入2%草酸制成匀浆。称取匀浆10 g于小烧杯中，倒入50 m1具塞量筒并用1%草酸溶液冲洗烧杯、稀释至刻度，振摇。如有泡沫影响定容可加数滴戊醇。将振摇后上层清液约20 ml倒入100 ml锥形瓶中，加白陶士一勺，振摇数次，使充分脱色，静置。同时，取一锥形瓶，加入1%草酸20 ml，加白陶士一勺，振摇数次作为空白。 （2）样品测定 取静置后上清液过滤，吸取滤液5.0 ml，以标定的2,