原理与技术课件.pptx

PCR原理与技术;PCR-polymerase chain reaction 聚合酶链式反应，实际上是一种体外的DNA复制技术。因此，它的过程与体内DNA复制有相似之处，只不过在体外就得采取体外的技术方法达到生物体内的效果。 体内DNA复制首先是将双链DNA打开，使用的是解旋酶。PCR技术是通过升高温度变性的方法。 体内DNA复制的引物由RNA聚合酶来完成，PCR是通过降温使人工合成的引物退火。 延伸都是聚合酶发生作用的阶段，只不过体内体外的温度不同。;PCR过程：变性、退火、延伸，此过程循环反应。 变性就是将双链的DNA打开，使其变成单链，以使引物可与其结合（碱基互补配对）。变性的方法就是升高温度到94℃-98℃，温度因酶而异。 退火就是缓慢降低变性温度至引物与模板结合。 延伸就是将温度升到聚合酶活性最佳温度，进行聚合反应。 以上3个过程完成一次为一个循环，一般PCR可以进行25-35次循环。扩增2^25-35倍。;??PCR的过程可知道，PCR反应的进行需要的条件为： DNA聚合酶 模板 引物 原材料和能量——dNTP 反应发生所需要的水盐环境 还有外部环境条件——温度（PCR仪提供） ;94℃ 3min （预变性） 94℃ 30s （变性） 60℃ 30s （退火） 72℃ 1min （延伸） 72℃ 10min （充分延伸） 4℃ hold （可有可无）;Taq酶 （有很多种聚合酶） Buffer （反应所需要的缓冲液，含镁离子等） dNTP 模板DNA （来自基因组DNA, 质粒，cDNA等） 引物DNA （公司合成） 无核酸酶的水;（4）dNTP dNTP浓度取决于扩增片段的长度 四种dNTP浓度应相等 浓度过高易产生错误碱基的掺入,浓度过低则降低反应产量 dNTP可与Mg2+结合,使游离的Mg2+浓度下降,影响DNA聚合酶的活性;（5） Mg2+ Mg2+是DNA聚合酶的激活剂。 0.5mmol/L-2.5mmol/L反应体系。 Mg2+浓度过低会使Taq酶活性丧失、PCR产量下降； Mg2+过高影响反应特异性。 Mg2+可与负离子结合,所以反应体系中dNTP、EDTA等的浓度影响反应中游离的Mg2+浓度; （1）变性 使双链DNA解链为单链 94℃ 20-30秒 （2）退火 温度由引物长度和GC含量决定。 增加温度能减少引物与模板的非特异性结合;降低温度可增加反应的灵敏性。 ;（3）延伸 70-75℃,一般为72℃ 延伸时间由扩增片段长度决定 （4）循环次数 主要取决于模版DNA的浓度 一般为25-35次 次数过多：扩增效率降低 错误掺入率增加 ; ;引物设计原则;引物设计常用资源;普通PCR 反转录PCR（rt-PCR） 巢式PCR 反向PCR 不对称PCR 实时PCR（real-time PCR，RT-PCR） /p-081712353458.html;反转录PCR是一种将逆转录和PCR技术偶联起来，检测基因表达的转录水平的一种技术。 它是先利用逆转录酶将RNA转录成cDNA，然后以cDNA为模板做PCR。 常用的逆转录酶有：鸟成髓细胞瘤病毒来源的AMV、Moloney 鼠白血病病毒来源的M-MLV rt-PCR有一步法和两步法两种。 ;18;逆转录;20;总 RNA 提取步骤（以细胞为例） 1、将细胞（六孔板、6cm培养皿）用冷PBS洗一遍，弃去PBS 2 、向培养皿中加1ml Trizol，反复吹打，并转移至1.5ml RNAse free的EP管中，室温放置5min，使细胞完全裂解 3 、加入200ul 氯仿，剧烈摇晃15s，12000rpm离心15min，4℃ 4、转移上清500ul至一个新的1.5ml RNAse free EP管中 5、加入500ul 异丙醇，充分混合，室温放置10min，12000rpm离心10min，4 ℃;6、弃去上清液，此时可见白色RNA沉淀 7、加入1ml 75%乙醇，轻轻洗沉淀，12000rpm离心5min，4 ℃ 8、小心弃去液体，开盖放置EP管，等待沉淀完全干燥 9、加入30~100ul RNAse free H2O，溶解RNA 10 、将EP管放置60 ℃加热器中10min，助溶RNA 11 、定量 12、 -80 ℃ 保存;RNA质量的鉴定;24;RT-PCR; 普通PCR ：终点定量，结果不稳定，反应环境、循环次数对结果影响较大，不能定量起始DNA模板数量。 Real-time PCR ： 灵