进出口动物源性食品的中三聚氰胺快速检测方法—ELISA编制说明书.doc

实用标准文案 PAGE 精彩文档 《进出口动物源性食品中三聚氰胺快速检测方法 ELISA法》编制说明 标准制定的任务来源及意义 本标准的制定工作是由中华人民共和国国家认证认可监督管理委员会提出并归口，由北京出入境检验检疫局研究起草，计划编号为2008B184。 本标准制定了进出口动物源性食品中三聚氰胺快速检测方法 ELISA法。 三聚氰胺（英文名Melamine，CAS:108-78-1，分子式C3N6H6）是一种用途广泛的有机化工原料，禁止在食品和动物食品中添加，但因其结构中含有多个氨基氮而被一些不法商贩添加到植物蛋白中以提高蛋白的含量。其危害最早源于2007年3月美国发生的宠物猫、狗中毒死亡事件。经美国FDA证实，猫、狗死亡是宠物食品的原料受三聚氰胺污染，并指出其中小麦蛋白原料来自中国，由此引起了国内外对三聚氰胺的高度关注。三聚氰胺一方面可能残留于食用动物组织，进而污染畜产品食品；另一方面，三聚氰胺也可以直接污染小麦、大米等谷物食品。无论何种污染途径，都可能危害人类健康、甚至造成人类中毒、死亡的危险。2008年9月16日，国家质检总局公布了全国婴幼儿配方奶粉22家生产企业的69批次产品检出了含量不同的三聚氰胺的检查结果，再次将三聚氰胺聚焦为食品安全检测中的重要检测对象。 三聚氰胺在食品中的限量值，目前仅针对乳和乳制品。对于婴幼儿配方奶粉限量值我国和香港地区、澳大利亚、新西兰、加拿大以及欧盟都制定在1mg/kg，美国没有对婴幼儿配方奶粉制定一个控制的限量；我国对其他乳和含乳15%的食品限量值为2.5mg/kg。三聚氰胺传统的检测方法有重量法、升华法，但方法检测限不能满足要求。近来发展起了色谱法。我国农业部发布《饲料中三聚氰胺的测定》公告，确定了饲料中三聚氰胺测定的农业行业标准NY/T1372-2007，该标准采用高效液相色谱法（HPLC）和气相色谱-质谱联用法（GC/MS），HPLC法最低定量限为2mg/kg，GC/MS法最低定量限为0.05mg/kg。2008年10月7号，国家质量监督检验检疫总局、国家标准化管理委员会批准发布了《原料乳与乳制品中三聚氰胺检测方法》（GB/T 22388-2008）国家标准，规定了高效液相色谱法、气相色谱-质谱联用法、液相色谱-质谱/质谱法三种方法为三聚氰胺的检测方法，检测定量限分别为2 mg/kg 、0.05 mg/kg 和0.01 mg/kg。2008年10月15日，又发布了《原料乳中三聚氰胺快速检测 液相色谱法》（GB/T22400-2008）国家标准，该标准的定量限为0.3 mg/kg。 然而，尽管色谱法已经很多，但不能完成现场大量样本的检测，而基于抗原抗体反应的免疫检测方法是一项大样本量现场快速的、准确的、成熟的筛查检测技术。本项目是参照美国Abraxis LLC公司建立的动物源性食品中三聚氰胺快速检测方法-ELISA法，制定相应的出入境检验检疫行业标准，作为 GB/T 22388-2008和GB/T22400-2008方法的补充，为实验室和现场针对动物源性食品中三聚氰胺快速筛查提供检测依据，更为保障我国人民食品安全及对外出口贸易健康发展提供有力的技术支撑。 编制依据 本标准是按照GB/T 1.1-2000《标准化工作导则 第1部分：标准的结构和编写的规则》、/GN/T 20001.4-2001《标准编写规则 第4部分：化学分析方法》及SN/T 0001-1995《出口商品中农药、兽药残留量及生物毒素检验方法标准编写的基本规定》（简称《基本规定》）的要求编写的。 本标准是经大量实验研究、评估和验证后制定的。 方法概述 基于竞争性ELISA的原理。先用甲醇-磷酸盐缓冲溶液(PBS)溶液将三聚氰胺从样品中萃取出来，再将所获得的样品萃取液与三聚氰胺辣根过氧化物酶（HRP）耦合物和标准品一起加入包备有三聚氰胺抗体的多孔试剂板的微孔中发生反应，经过30分钟的培养，样品中的三聚氰胺和三聚氰胺HRP酶耦合物与三聚氰胺抗体竞争性结合。经过这30分钟的培养，任何没有结合的三聚氰胺和三聚氰胺HRP酶耦合物将被冲洗掉，显色酶底物加入微孔中，任何结合的酶耦合物都会使液体呈现蓝色。经过10-20分钟的培养，反应结束，用酶标仪读数。将未知样品的读数和标准品的读数比较就能得出样品中的三聚氰胺浓度。 主要实验技术论证 酶联免疫法之所以能够方便快捷地应用在食品分析中主要是由于其不需要经过繁琐的净化步骤，从而大大缩短了时间。实验比较了超纯水、PBS、PBST等几种常用的掩蔽剂对于消除基质影响的作用情况。结果显示采用PBS作为基质掩蔽剂可较好地消除基质影响。 方法的主要技术指标 1、方法检测限 研究建立的三聚氰胺直接竞争ELISA检测方法，其标准溶液的线性范围为20～500 μg/L。经加标回收试验，针对婴儿奶