双荧光素酶系统实验操作步骤及办法_.ppt

双荧光素酶报告系统 一、概述 报告基因 (reporter gene):是一种编码可被检测的蛋白质或酶的基因，也就是说，是一个其表达产物非常容易被鉴定的基因。 一般的，把报告基因的编码序列和基因表达调节序列相融合形成嵌合基因，或与其它目的基因相融合，从而利用它的表达产物来标定目的基因的表达调控。 在动物基因表达调控的研究中，报告基因被广泛应用。如绿色荧光蛋白(GFP）和荧光素酶。 荧光素酶（Luciferase）：是能够催化不同底物氧化发光的一类酶的统称，哺乳细胞无内源性荧光素酶。 荧光素酶报告基因的优点 蛋白不需要翻译后加工，所以一旦翻译立即产生报告活性。 在所有的化学发光反应中，它的光产物具有最高的量子效率，因而非常灵敏。另外，在宿主细胞及检测试剂中均检测不到背景发光。 检测快速，每个样品只需几秒钟。 二、实验原理 利用荧光素酶与底物结合发生化学发光反应的特性，把感兴趣的基因转录的调控元件克隆在萤火虫荧光素酶基因（firefly luciferase）的上游， 同时，为了减少内在的变化因素（如：培养细胞的数目和活力的差别，细胞转染和裂解的效率等）对实验准确性的影响，将带有海肾荧光素酶基因（Rinilla luciferase）的质粒（phRL-TK）作为对照质粒与报告基因质粒共转染细胞，提供转录活力的内对照，使测试结果不受实验条件变化的干扰。 在测量过程中，当加入荧光素酶检测试剂II (LARII)时产生萤火虫荧光信号，这样先测量萤火虫荧光素酶报告基因。定量萤火虫荧光强度之后，再在同一样品中加入Stop Glo? 试剂，将上述反应淬灭，并同时启动海肾荧光素酶反应，同时进行第二次测量。 三、操作程序与结果判定 A．检测前相关试剂配制 1. 1X PLB裂解缓冲液配制：将4×体积水或PBS加入1×体积5X PLB裂解缓冲液。（使用前在室温平衡1X 缓冲液，平衡需2-3 min）。 2. Luciferase Assay Reagent II (LAR II) 配制：将Luciferase Assay Buffer II加入Luciferase Assay Substrate充分混合后，分装，置于-20℃避光保存。（一次配好，分装成小管，避免反复冻融），使用前将配好的LAR II从-20℃拿出，并平衡至室温（需20-30min）。 3. Stop Glo? Reagent配制：现用现配，先将Stop Glo? Buffer放在37度温箱中平衡至室温（15-30min），再将1倍体积的50X Stop Glo? Substrate加入49倍体积的将Stop Glo? Buffer中。 B．样品制备 1. 仔细地将生长培养基从待检细胞孔中吸出。用1XPBS漂洗细胞2-3次。此过程必须仔细，并尽量将漂洗用PBS 吸尽（防止细胞掉落）。 2. 24 孔板每孔加入100-150μl 1X 裂解缓冲液PLB以覆盖细胞。然后将24孔板置摇床振摇20-30min以保证裂解缓冲液完全裂解细胞。 C．双荧光素酶检测（Promega GLOMAX） (注：系统运行时请勿触摸操作屏) 1. 重新设定系统：Tools Settings Reset 2. 双荧光素酶检测程序的设定： Protocols Run Promega Protocol DLR-O-INJ OK 3.将50μl LAR II加入1.5ml EP管中（专用的进口EP管），取10μl 细胞裂解液加入装有LAR II的1.5ml EP管中，吹打2-3次混匀（尽量不要吹出气泡），置于检测仪，点击“Measure” 开始读数（为萤火虫荧光素酶反应强度）。（使用前LAR II要混匀，并平衡到室温） 4. 测量结束后，取出EP管，再加入50μl Stop Glo? Reagent，吹打2-3次混匀（尽量不要吹出气泡），再次置于检测仪，点击“Measure” 开始读数（为内参海肾荧光素酶反应强度）。（Stop Glo? Reagent 现配现用，不能保存） 5. 记录读数: 每个样品会有3个数值：RLU1——萤火虫荧光素酶反应强度, RLU2——内参海肾荧光素酶反应强度, Ratio——RLU1/ RLU2。一般记录Ratio 值即可，但RLU1 和RLU2为实际荧光强度值，可以反映细胞的转染效率，也可根据实际荧光强度来调整报告质粒与内参的比例。 6. 测量完毕后，请将最后检测的EP管取出后，关闭仪器。 7. 实验结果的处理与分析：采用双样本等方差t检验进行处理，P＜0.05为差异显著，P＜0.01为差异极显著。 四、注意事项 由于温度对酶反应有影响，所以测定时样品和试剂均需达