拟南芥TDNA插入突变.ppt

用PCR筛选出突变纯合体后，便可以利用反向遗传学的思路对纯合突变体进行一系列的基因功能的研究。基因敲除所产生的突变表型，是该基因缺失后的表型，因而直接表明了该基因的功能与表型的关系，人们由此可以直接快速的检测得到基因的功能。 然而，有很多基因敲除突变体没有很明显的表型作用。 （4）表型鉴定 * 表型不明显的原因 由于重复基因的存在，一个基因成员的突变导致的功能丧失会被另一个重复基因所弥补。 有些突变个体只有在特定的环境下、特定生长时期、特定生理状态下才表现突变性状，这类基因若在非表达阶段被突变，则不会产生明显的表型突变 一些基因控制生物的代谢过程，并没有表型的改变 在多个生长阶段发挥作用的基因，其突变可能导致早期胚致死效应，因而也无法鉴定。 瞬间表达的基因、低水平表达的基因，以及在少数细胞中表达的基因，都很难用基因敲除突变体鉴定。 （Patrick J. Krysan et al，1999 ） （赵霞，周波等，2009） （4）表型鉴定 * 表型鉴定应对策略 Knock-knock 突变体 环境胁迫 基因捕获载体和激活标签载体。 （4）表型鉴定 * Knock-knock 突变体 （Patrick J. Krysan et al，1999 ） （4）表型鉴定 * 突变-表型 One can easily determine the precise genotype of large numbers of individual plants by using the T-DNA insertion as a PCR marker for the mutant locus. Such analysis, however, does not prove that the PCR-identified, T-DNA–induced mutation is responsible for the phenotype rather than a closely linked, unrelated mutation. （4）表型鉴定 方法 isolate additional mutant alleles for the locus complement the mutation by introducing a wild-type copy of the gene into mutant plants （Patrick J. Krysan et al，1999 ） * 表型鉴定的一般思路 （4）表型鉴定 * 4、T-DNA的研究方向与价值 近年来，借助于农杆菌介导的遗传转化技术，T-DNA插入技术已被广泛应用于拟南芥等模式植物的突变体库构建中。 在植物功能基因组学研究中发挥着重要作用，广泛应用于大规模植物基因功能分析，是分离新基因、研究基因功能的有效工具。 构建突变体库，是反向遗传学的突破性技术之一 * 局限性： ①利用T-DNA插入突变体研究新基因，要求创建饱和突变体库，需要进行大规模的转基因工作，因此实验材料需要具有完善的遗传转化体系（水稻、拟南芥等模式生物）。 ②T-DNA转移和整合机制尚不清楚，有时会出现多拷贝插入，且容易产生直接的串联、反向重复和边界缺失等。 4、T-DNA的研究方向与价值 * Our team * * 拟南芥幼苗的移植 用镊子小心地将幼苗从培养基中取出，移入土，此过程中注意保护幼苗的根部。 用营养土和蛭石以1：1的比例混合拌匀配制，以保证营养及透气性。之前用高温杀菌以杀死土中的害虫。 在不伤根的情况下用镊子尾部将幼苗小心插入挖好的小洞中，用土掩埋幼苗根部。掩埋过程中注意保持土质疏松。 一般直径为8cm的小花盆中种植1-2株即可。 * * * 移植后幼苗的培养 幼苗移植后将花盆用塑料薄膜覆盖，置于21℃，6300（±300）lx光照强度下，前4-6天，每隔两天浇一次营养液以保持土质湿润。 当植株叶子出现明显伸长，茎开始发育时去掉薄膜。此后为使植株更好的生长和诱导开花，可将光照时间延长至14-16h。注意保持土质湿润。 出现花芽时，一定保持水分供应，以促进果实发育。 结有豆荚后，减少水分供应至每周一次，以促进种子成熟。 * * * CTAB法