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核酸分析技术 电泳技术 电泳缓冲液 6×凝胶载样缓冲液 核酸电泳的指示剂 核酸电泳的染色剂——溴化乙锭 DNA的迁移速率决定因素 1 DNA分子的大小 双链DNA分子迁移的速率与其碱基对数的常用对数近似成反比； 2 琼脂糖浓度 浓度越低，相同核酸分子迁移越快； 3 DNA的构象 超螺旋环状＞线状＞切口环状。 4 凝胶和电泳缓冲液中的溴化乙锭 溴化乙锭（EB）插入双链DNA造成其负电荷减少、刚性和长度增加。 5 所用的电压 低电压时DNA片段迁移率与所用的电压成正比。 6 琼脂糖种类 常见的有两种：标准琼脂糖和低熔点琼脂糖； 在TEMED (四甲基乙二胺) 催化过硫酸铵还原产生的自由基的存在下，丙烯酰胺单体的乙烯基聚合形成聚丙烯酰胺的线状长链。 在双功能交联剂如N，N`-亚甲双丙烯酰胺的参与下的共聚合反应中，聚丙烯胺的交联形成三维带状网格结构。 网格孔径的平均直径决定于丙烯酰胺和双功能交联剂的浓度。 优点 聚丙烯酰胺凝胶具有机械强度好，有弹性，透明，化学性质稳定，对pH和温度变化小，没有吸附和电渗作用小的特点，是一种很好的电泳支持介质。 （二） 聚丙烯酰胺凝胶电泳种类 1 变性聚丙烯酰胺凝胶 用于单链DNA片段的分离或纯化。 变性的DNA在这些凝胶中的迁移率几乎与其碱基组成及序列完全无关。 用途：放射性DNA探针的分离、DNA测序反应等。 2 非变性聚丙烯酰胺凝胶 用于双链DNA片段的分离和纯化。 注：迁移率受其碱基组成和序列的影响。 用途：制备高纯度的DNA片段。 ㈢ 染色 考马斯亮蓝染色 考马斯亮兰G-250染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰(lmax)的位置，由465nm变为 595nm，溶液的颜色也由棕黑色变为兰色。通过测定595nm处光吸收的增加量可知与其结合蛋白质的量。研究发现，染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸(特别是精氨酸)和芳香族氨基酸残基相结合。 银染色 银染色液中的银离子(Ag )可与核酸形成稳定的复合物，然后用还原剂如甲醛 使Ag 还原成银颗粒，可把核酸电泳带染色黑褐色。主要用于聚丙烯酰胺凝胶电泳染色。 也用于琼脂糖凝胶染色。其灵敏度比EB高200倍。但银染色后，DNA不宜回收。 ㈣ DNA在聚丙烯胺凝胶中的有效分离范围 12 45 6~100 20.0 15 60 25~150 15.0 20 70 40~200 12.0 45 160 60~400 8.0 65 260 80~500 5.0 100 460 1000~2000 3.5 溴酚蓝 二甲苯氰FF 有效分离范围 （bp） 丙烯酰胺浓度 （%） 注:N,N`-亚甲双丙烯酰胺的浓度为丙烯酰胺的1/30; PAGE电泳装置 PAGE的结果观察 考马斯蓝染色 凝胶成像仪扫描 末端终止法——Sanger 2’，3’双脱氧核苷三磷酸（ddNTP）是DNA合成链延伸的抑制剂。 核苷酸序列测定 DNA序列分析仪： 四色荧光基团标记的dNTP （二）DNA的化学法测序： 由Maxam和Gilbert所发明。 其基本原理是用特异的化学试剂作用于DNA分子中的不同碱基，然后用哌啶切断反应碱基的多核苷酸链。用4组不同的特异反应，可使末端标记的DNA分子切成不同长度的片断，其末端都是该特异的碱基。经变性胶电泳和放射自显影得到测序图谱 基本介绍 利用电泳现象对混合物进行分离分析的技术 工作原理 样品的电荷效应 凝胶的筛选效应 介绍常用方法 琼脂糖凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳 常用核酸测序方法 SANGER双脱氧链终止法的原理 作业 优点：操