高糖对人晶状体上皮细胞inos表达机制及丹酚酸b作用的研究中西医结合基础专业论文.docxVIP

中文摘要高糖对人晶状体上皮细胞iNOS表达机制 中文摘要 高糖对人晶状体上皮细胞iNOS表达机制 及丹酚酸B作用的研究 摘 要 目的：在全球致盲疾病中，白内障位居第一。近年来，随着糖尿病发 病率的迅猛增长，糖尿病性白内障(diabetic cataract，DC)已成为糖尿病 患者失明的主要原因。在我国，年龄标准化后的总糖尿病患病率和前驱糖 尿病患病率分别达9．7％和15．5％，其中有9240万成年糖尿病患者和1．5亿成 年前驱糖尿病患者。2型糖尿病患者的白内障发病率竟达60％以上。因此， DC的发病机制及防治已成为当前研究的焦点。 研究证实，氧化应激是糖尿病慢性并发症发生的主要机制，导致氧化 应激的关键酶是诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase， iNOS)，iNOS一旦被诱导，即可合成大量NO，活性持续可达20h。NO极 易与超氧阴离子反应生成过氧亚硝基阴离子(peroxynitrite，ON00。)， 而ONOO。及其衍生物是目前已知氧化能力最强的一类物质，其氧化能力 是H202的2000多倍，可引起剧烈的氧化应激反应，引发或加速DC的发生。 己知氧化应激关键酶iNOS的主要调控因子是核转录因子．rB(nuclear factor-kappa B，NF．rB)，而且其基因启动子中含有NF．rB的结合位点。 常态下，NF．rB滞留于细胞质中，以最常见的P65／P50二聚体形式存在， 处于失活状态。当细胞受到高糖等因素刺激时，NF—rB被激活，移位至细 胞核内，与NF．rB调控位点结合，发挥其调控基因转录的功能。 我们的前期研究发现，离体培养的人晶状体上皮细胞株SRAOI／04受 高糖刺激后，NF．J(B P65的表达量明显增加，并迅速移位至细胞核内。那 么，进入细胞核后的NF．rB P65是否会与iNOS基因启动子结合，高糖能 否增强它们的结合能力，又能否激活iNOS基因的转录和表达，有待研究 证实。 丹酚酸B(Salvianolic acid B，SalB)为中药丹参中重要的水溶性药 效成分，在结构上含有多个游离酚羟基，具有极强的抗氧化和清除自由基 能力，其抗氧化能力约为维生素E的1000倍，是目前已知的抗氧化作用 最强的天然产物之一，能够抑制晶状体脂质过氧化反应。那么，丹酚酸B 中文摘要对于DC的防治作用是什么，机制如何，是否与iNOS基因的转录有关? 中文摘要 对于DC的防治作用是什么，机制如何，是否与iNOS基因的转录有关? 本实验采用含高糖的DMEM培养基，孵育正常培养的SRAOI／04细 胞，观察iNOS的表达变化，利用染色体免疫共沉淀(Chromatin Immunoprecipitation，CHIP)技术研究NF．rB P65与iNOS启动子的结合 能力。同时，本实验还观察了SalB对iNOS表达的影响，为临床防治DC 提供基础实验依据。 方法： 1细胞培养与分组 选用人晶状体上皮细胞株SRAOI／04作为试验用细胞，采用低糖 DMEM培养基培养。当细胞生长满度达培养瓶底面积的80％时，进行传代。 为研究葡萄糖对iNOS表达的影响，对细胞进行随机分组，按葡萄糖 浓度的不同，分为4组：5．5mmol／L葡萄糖组(正常对照组)、15mmol／L 葡萄糖组、25mmol／L葡萄糖组、30mmol／L葡萄糖组，分别孵育细胞8h； 按葡萄糖刺激细胞时间的不同，分为5组：Oh组、lh组、2h组、4h组、8h 组。 为观察SalB对iNOS表达的作用，将细胞随机分为4组：5．5mmol／L葡 萄糖组(正常对照组)、25mmol／L葡萄糖组、25mmol／L葡萄糖+30mmol／L SalB组、25mmol／L甘露醇组，分别孵育细胞8h。 为探讨高糖对iNOS表达影响的机制，用5．5mmol／L葡萄糖组和 25mmol／L葡萄糖组细胞进行试验。 2晶状体上皮细胞iNOS转录水平的变化 2．1总RNA的提取：Trizol试剂盒法。 2．2 mRNA的测定：用届．actin做内参，利用RT．PCR法测定iNOS mRNA。 3晶状体上皮细胞iNOS蛋白表达的变化 3．1细胞总蛋白的提取：细胞裂解液法。 3．2蛋白定量：Lowry法。 3．3晶状体上皮细胞iNOS蛋白的检测：Westem-blotting法。 4高糖对SRAOI／04细胞iNOS表达影响的机制：ChIP技术。 结果： 1不同浓度葡萄糖对iNOS表达的影响 高糖组iNOS mRNA的表达均升高，与正常对照组相比，差异有统计 中文摘要学意义(P0．05)；25mmol／L葡萄糖组和30mmol／L葡萄糖组iNOS 中文摘要 学意义(P0．05)；25mmol／L葡萄糖组和30mmol／L葡萄糖组iNOS mRNA 的表