2第二章基因工程的工具酶.ppt

S1核酸酶的基本反应II：内切带缺口或裂口的双链DNA或RNA 5’… G-C-T-C-A-G C-T-G-G-A-G-T… 3’ 3’ … C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A… 5’ 5’ … G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T… 3’ 3’ … C-G-A-G-T-C A-C-C-T-C-A… 5’ nick gap S1 nuclease Zn2+ 5’… G-C-T-C-A-G 3’… C-G-A-G-T-C T-G-G-A-G-T… 3’ A-C-C-T-C-A… 5’ S1核酸酶的重要用途 去除DNA片段的单链突端，使之成为平端 去除cDNA合成时形成的发夹结构 通过S1核酸酶保护实验，分析转录产物 成熟mRNA与基因组DNA杂交后，结合此酶水解，可定位内含子 修整渐进性删除突变的末端 S1核酸酶的重要用途：定位内含子（S1 mapping） EcoRI 杂交 S1 mRNA DNA * * 第二章 基因工程的工具酶（6学时） 6.单链内切双链外切的核酸酶：Bal31核酸酶 从双链DNA的两端（3’和5’）同时水解两条链 对两条链的水解速度不一定相等 结果是双链从两头缩短，彻底水解为单核苷酸 Bal31核酸酶的基本特性：来自艾氏交替单胞菌（A. espejiana） Ca2+ 5’ dNMPs 或 5’ NMPs ssDNA or RNA Ca2+ Ca2+ Bal31 Bal31 Bal31 Bal31核酸酶的基本用途：用于不同长度的删除突变克隆实验 EcoRI A B C EcoRI EcoRI B C A Bal31 B C A 环化 A C S1 nuclease Berk和Sharp（1977）提出的经典S1核酸酶保护试验技术的改良。含有目的mRNA的RNA样品与互补的DNA或RNA探针在利于形成杂合体的条件下温育。在反应的末期，S1酶用来降解未杂合的单链RNA和DNA。剩下的DNA-RNA或RNA-RNA杂合体用凝胶电泳分离，接着用自显影或Southern杂交来观察。当探针的摩尔数在杂交反应中过量时，信号的强度和样品中的目的mRNA的浓度成正比。用过量探针与一系列定量靶序列杂交作出标准曲线，从而准确估算样品浓度。 * 5’ p 3’ HO OH 3’ p 5’ TdT Co2+/Mg2+，dATP 5’ p 3’ HO AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA OH 3’ p 5’ 5’ p 3’HO OH 3’ p 5’ TdT Co2+/Mg2+，dATP 5’ p 3’ HO AAAAAAAAAAAAAA OH 3’ p 5’ AAAAAAAAAAAAA TdT的基本用途 给载体或目的DNA加上互补的同聚物尾巴 DNA片段3’末端的同位素标记 6.依赖于RNA的DNA聚合酶（反转录酶） 反转录酶的基本特性I：RNA指导的cDNA合成 3’AAAAAAAAAAAAAA 5’mRNA 反转录酶 Mg2+，dNTP 5’TTTTTTTTTTTT oligo (dT) 12-18 3’AAAAAAAAAAAAAA 5’mRNA 5’TTTTTTTTTTTTTT 3’cDNA 反转录酶的基本特性II：双向外切DNA-RNA杂合链中的RNA链（RNase H活性） 反转录酶 3’ RNA 5’ DNA 3’ 5’ 3’ RNA 5’ DNA 3’ 5’ 反转录酶 5’ DNA 3’ 反转录酶的基本特性III： DNA指导的DNA聚合酶活性 基因工程中常用的反转录酶 AMV：一种提取自纯化的禽成髓细胞瘤病毒的反转录酶 禽源反转录酶在42℃发挥作用 鼠源反转录酶在37℃发挥作用 MMLV：一种是Moloney鼠白血病病毒（MMLV）克隆的反转录酶基因在大肠杆菌中的表达产物 反转录酶的基本用途 将真核基因的mRNA转录成cDNA，构建cDNA文库 对具有5’突出端的DNA片段的3’端进行补平和标记、制备探针 代替Klenow片段，用于DNA序列测定 7.耐热DNA聚合酶（Taq酶） Taq酶的特点 热稳定性 离子依赖性 忠实性较差：具备5’-3’聚合酶活性和5’-3’外切酶活性；但没有3’-5‘校正活性，会在末端加一个A。 三、DNA连接酶（DNA ligase） 1.DNA连接酶的发现 1967年，世界上有数个实验室几乎同时发现了一种能够催化2条DNA链间形成磷酸二酯键的酶，即DNA连接酶（1igase）。 这种酶需要在一条DNA链的3’末端具有一个游离的羟基(-OH)，另一条DNA链的5’末端具有一个磷酸基团(-P)。只有在这种情况下，才能发挥其连接DNA分子的作用。 * * 第二章 基