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实验九 金免疫技术 实验目的 了解胶体金和免疫金的制备方法 了解蛋白质最适标记量的确定 了解斑点金免疫渗滤试验和斑点金免疫层析试验原理 掌握金免疫测定技术 实验内容 胶体金的制备 免疫金的制备 斑点金免疫渗滤试验和斑点金免疫层析试验 尿HCG测定-斑点金免疫层析试验 金免疫技术：以胶体金作为标记物的免疫标记技术。 胶体金：指金微小粒子（1－100nm）分散在溶液中所形成的金溶液。是由金盐被还原成原金后形成的金颗粒悬液。 用金溶胶标记蛋白质（抗原、抗体或SPA、SPG） 胶体金具有高电子密度的特性，故金标蛋白抗原抗体结合处，显微镜下可见黑色颗粒；当这些标记物在标记处大量聚集时，可在载体膜上呈现肉眼可见红色或粉红色斑点，以此用于抗原抗体物质的定位或定性。 分类 一、金免疫组化染色技术 金（银）免疫光镜染色技术 金免疫电镜染色技术 二、金免疫测定技术 斑点金免疫渗滤试验 斑点金免疫层析试验 第一节 胶体金与免疫金的制备 一、胶体金的特性及制备 1、结构： 胶体金颗粒由一个基础金核（原子金Au）及包围在外的双离子层构成，紧连在金核表面的是内层负离子（AuCl2-），外层离子层（H+）则分散在胶体间溶液中，以维持胶体金游离于溶胶间的悬液状态。 形状：小的胶体金颗粒（1-30nm）呈球形，大的胶体金颗粒（30-100nm）呈椭圆形 2、胶体金的一般性状 稳定性：稳定地、均匀地、呈单一分散状态悬浮在液体中，成为胶体金溶液。 对电解质的敏感性：打破胶体金的稳定，使分散的金颗粒凝聚成大颗粒，而从液体中沉淀下来。 影响胶体金溶液稳定性的因素 1、胶粒间的相互吸引力。当胶粒相距很近时，这种吸引力可能导致胶粒合并变大。 2、水化层的带电情况。一种溶胶的各个胶粒都带有相同的电荷。同性电荷相斥，双电层愈厚，胶粒带电量愈大，排斥力愈大，愈能阻止胶粒合并聚结，溶胶愈稳定。 3、胶体界面的溶剂膜，当二固体间夹有一厚层液体时，这层液体膜有一个反抗二固体接近的排斥力。两个胶粒要进一步接近，只有克服它们之间的溶剂化膜的斥力才有可能，因此溶剂膜的斥力是使溶胶稳定的原因之一。 颜色和光吸收性： 通过改变柠檬酸钠的用量可制得不同大小的胶体金颗粒 3、胶体金的制备方法 原理：向一定浓度的金溶液内加入一定量的还原剂使金离子变成金原子，形成金颗粒悬液。 常见的还原剂：白磷、乙醇、枸橼酸钠、鞣酸等 方法： 所有容器要求干净，用酸或重铬酸钾洗液泡洗，用双蒸水冲洗干净。 配制氯化金溶液：取氯化金1克，溶于100ml双蒸水中，配成1%的水溶液。放在4”c冰箱内保存长达几个月至1年左右，仍保持稳定。 取上述氯化金溶液，稀释100倍，即成0.01%的氯化金溶液。 加热至沸腾，加适量柠檬酸三钠搅动，加热至沸（约2～3min*），冷却，加蒸馏水至原体积 * 见淡黄色的氯金酸水溶液在柠檬酸钠加入后很快变灰色，续而转成黑色，随后逐渐稳定成红色。 4、胶体金的鉴定 主要检查指标有颗粒大小，粒径的均一程度及有无凝集颗粒等。在日光下仔细观察比较胶体金的颜色，可以粗略估计制得的金颗粒的大小。当然也可用分光光度计扫描λmax来估计金颗粒的粒径。 肉眼、分光光度计、电镜等方法观察 应为清亮透明的液体 若胶体金混浊或液体表面有漂浮物，则制备的胶体金有较多的凝集颗粒 要得到大小更均匀的胶体金颗粒，可采用甘油或蔗糖密度梯度离心。 5、胶体金的保存 洁净的玻璃器皿中可较长时间保存； 少许防腐剂（如0.02％NaN3）可有利于保存。 胶 体 金15~60 nm 6、制备胶体金的注意事项 （1）氯金酸易潮解，应干燥、避光保存。 （2）氯金酸对金属有强烈的腐蚀性，不应使用金属药匙称量氯金酸。 （3）制备胶体金应用双蒸/三蒸馏水，或者是 高质量的去离子水。 （4）玻璃容器必须是绝对清洁的，最好是经硅化处理的。 二、免疫金的制备 免疫金：是指胶体金与抗原或抗体等的结合物，在免疫组织化学技术中，习惯上要称之为金探针。 制备方法： 1 ．胶体金溶液的pH值调整 2．蛋白质最适标记量的确定 3．标记过程 4．离心去除未结合的蛋白质，反复洗涤2～4次 5．免疫金最终用稀释液配成工作浓度保存 1 ．胶体金溶液的pH值调整 用0.1mol/L K2CO3或0.1mol/L HCL调节PH至选定值，原则上选择待标记蛋白的等电点，也可略为偏碱，通常最适PH值需经过多次试验进行调整。 使用PH试纸进行调整，金颗粒容易吸附于电极上使之堵塞，所以不能用pH电极直接测定金溶液的pH值。应选用缓冲容量足够大的缓冲液(例如PEG20000液)稳定胶体金后再测定或保存。 2．蛋白质最适标记量的确定 将待标记蛋白作一系列稀释后各取一定量加入装有一定量胶体金的试管中，