李博 13301050200.docx

已知： A药物具有保护心肌细胞免受缺血损伤的作用； 心肌细胞缺血过程中B基因的表达产物B蛋白表达量会发生改变。 实验目的： 明确B基因的表达产物与心肌细胞缺血间的关系； 明确在A药物保护心肌细胞免受缺血损伤的过程中，B基因的表达产物是否参与其中。 实验1：关于B基因的表达产物与心肌细胞缺血间的关系研究 实验方法： 大鼠心肌细胞原代培养。 取大鼠一只，无菌条件下取出心脏，缓冲液清洗，将心脏剪成1cm*3小块，有胰蛋白酶和胶原蛋白酶消化交替进行消化处理，消化时置于37℃水浴磁力搅拌器上，每次8min。取上清加入含10%胎牛血清的DMEM培养基终止消化，离心后，去上清，用含10%胎牛血清的培养基重悬细胞，保存于37℃CO2培养箱。将心肌组织分次消化收集，最后将收集的细胞悬液用200目滤网过滤，将过滤后的细胞悬液置于培养皿中，于5%二氧化碳、37℃培养箱中贴壁2h。收集未贴壁的细胞悬液，加入0.1mmol/L Brdu，吹打后接种于35mm培养皿（2ml/皿），接种后48h首次换液，继续加入0.1mmol/L Brdu，心肌细胞培养5d。 建立心肌细胞缺血模型。 5d后，取12皿，弃去10%胎牛血清的DMEM低糖培养基，每培养基加入2ml不含血清的DMEM无糖培养基，其中6皿加入B基因的抑制剂，在0.5%氧气，5%二氧化碳，94.5%氮气，37℃条件下培养，分别在1h、2h、3h后分别取出2皿普通缺血和2皿加入抑制剂的，进行后续实验，构成1h普通缺血组，2h普通缺血组和3h普通缺血组以及1h抑制剂缺血组，2h抑制剂缺血组和3h抑制剂缺血组。未缺血培养的取4皿，2皿正常培养，2皿加入抑制剂，构成空白对照组和抑制剂对照组。（细胞模型如下表） 组别 空白对照 抑制剂对照 1h缺血 2h缺血 3h缺血 1h缺血+抑制剂 2h缺血+抑制剂 3h缺血+抑制剂 缺血 - - + + + + + + 抑制剂 - + - - - + + + 免疫组化方法测定B蛋白表达量。 上述各组细胞每组各取1皿，吸弃培养液，PBS洗3次，甲醇固定5min，PBS洗3次，加入封闭液，37 ℃，30-60min，吸去上清液；加一抗，37 ℃恒温1-2h后置4℃冰箱过夜。第二天取出，PBS洗3次；加二抗，37 ℃恒温1-2h后，PBS洗3次，加0.3％ H2O2-PBS，37 ℃，30min；PBS洗3次；加SABC工作液，37 ℃，30min；PBS洗3次；DAB显色，镜下控制，以蒸馏水终止反应后观察结果。 CCK-8法测细胞活力。每组取剩余的一皿，吸弃原培养液，加 CCK-8 工作液，继续培养，待CCK-8 作用1h，在450nm波长处比色，测定吸光度，分析各皿心肌细胞活力。 实验结果分析： 通过比较模拟缺血时间不同组别之间细胞活力和B蛋白表达量的关系，定性地指出B蛋白与心肌细胞缺血的关系，是正相关还是负相关。比较B蛋白表达量的相对多少（根据色差），用假设检验，明确B蛋白和心肌细胞缺血时间和细胞活力的关系。（1）若B基因的表达量随缺血时间的增加即细胞活力下降而相对增加，可认为B蛋白参与抗心肌细胞缺血损伤。（2）若B蛋白表达量随缺血时间增加而相对增加，但B基因被抑制后，细胞活力降低程度减少，说明B蛋白可能在损伤发生后促进细胞凋亡。（3）若B蛋白表达量随缺血时间增加而下降，且抑制组中，抑制组和未抑制组中细胞活性降低程度相仿，则认为可能是因心肌细胞缺血损伤导致B蛋白表达量下降，说明 B蛋白参与未损伤时的参与正常生命活动，在损伤后，该正常活动被破坏。 实验2：A药物保护心肌细胞免受缺血损伤的过程中，B基因的表达产物是否参与其中。 1.药物组和对照组设立。 取实验1中原代培养乳鼠心肌细胞8皿依照实验1的方法进行心肌缺血模拟（都进行缺血2h处理），之后进行如下处理： 组别 对照组 药物组 药物+抑制组 抑制组 A药物 - + + - 抑制剂 - - + + 每组2皿。 依照实验1中的方法对细胞进行免疫组化测定B蛋白表达量和细胞活力测定。 实验结果分析：（1）若药物组心肌细胞缺血损伤缓解，抑制组损伤加剧，药物+抑制组损伤介于二者之间则说明B蛋白可能参与A药物的作用，但同时A药物也可以通过其他途径治疗该疾病。（2）若药物组心肌细胞缺血损伤缓解，抑制组损伤加剧，药物+抑制组损伤同抑制组，说明B蛋白参与A药物的作用，且A药物必须通过B作用。（3）若药物组损伤缓解，抑制组损伤加强，药物+抑制组损伤也缓解，说明B蛋白不参与A药物的作用。