基因工程制胰岛素课件.ppt

感受态细胞的制备： 1、从新活化的E.coli DH5α平板上挑取一单菌落，接种于3～5ml LB液体培养中，37℃振荡培养至对数生长期(12h左右)； 2、将该菌悬液以1:100～1:50转接于100ml LB液体培养基中，37℃振荡扩大培养，当培养液开始出现混浊后，每隔20～30min测一次OD600，至OD600为0.3～0.5时停止培养，并转装到1.5 mL离心管中； 3、培养物于冰上放置20min； 4、 0～4℃，4000g离心10min，弃去上清液，加入1 mL冰冷的0.1mo1／L CaCl2溶液，小心悬浮细胞, 冰浴20分钟； 五、重组DNA导入表达细胞 * * 5、0～4℃， 4000g离心10min，倒净上清培养液，再用1.0 mL冰冷的0.1mo1／L CaCl2溶液轻轻悬浮细胞，冰浴20min； 6、 0～4℃， 4000g离心10min，弃去上清液，加入100 μL冰冷的0.1mo1／L CaCl2溶液，小心悬浮细胞，冰上放置片刻后，即制成了感受态细胞悬液； 制备好的感受态细胞悬液可直接用于转化实验，如果在4℃放置12～24h，其转化效率可以增高4～6倍；也可加入占总体积15％左右高压灭菌过的甘油，混匀后分装于1.5ml离心管中，置于-70℃条件下，可保存半年至一年。 五、重组DNA导入表达细胞 * * * 六、重组体细胞的筛选纯化鉴定 在重组DNA导入受体细胞的实验中，由于重组率很低，因此需要从这些细胞中筛选出期望重组子，将转化后的细胞涂布于特定的固体培养板，生长出的单菌落或噬菌斑进一步筛选和鉴定。 * * 1、载体遗传标记法（抗生素抗性筛选法、营养缺陷型筛选法、噬菌斑筛选法、互补筛选法） 2、核酸分子杂交法 菌落原位杂交：制备与目的基因某一区域同源的探针序列，根据核酸杂交原理，探针序列特异性的杂交目的基因，并通过放射性同位素或荧光基团进行定位检测。 六、重组体细胞的筛选纯化鉴定 * * 3、目的基因表达产物测定法 如果重组DNA的目的基因能在宿主细胞中编码蛋白质，且宿主细胞本身不含该蛋白质，那么可以通过检测蛋白质的生物功能或结构来筛选和鉴定重组子。 六、重组体细胞的筛选纯化鉴定 * 用荧光原位标记筛选重组体 1、制备核酸探针，通过数据库查询所需的寡核苷酸探针的资料，用ＤＮＡ合成仪合成，然后用荧光素进行标记。 ２、将样品进行打碎、离心、清洗等步骤，使微生物细胞与杂质进行分离，同时增大细胞壁的通透性，保证探针算例进入与ＤＮＡ杂交。 ３、配置杂交液，其中杂交液中的甲酰胺的浓度直接影响杂交的特异性，将杂交液与样品之一杂交炉（避光、密封），杂交完成后用洗脱液（ＳＥＴ或ＳＳＣ）将多余的探针除去。 ４、加少量的苯二胺－甘油溶液覆盖样品，防止荧光淬灭，再封片，用荧光显微镜观察、照相进行分析。 六、重组体细胞的筛选纯化鉴定 * * 荧光原位杂交技术 荧光原位杂交是一种非放射性原位杂交方法，将荧光标记的探针与待测序列进行杂交，根据杂交信号的有无及类型达到诊断的目的。 原理：基于碱基互补配对的原则，用荧光素标记的已知外源DNA或RNA作探针，与载玻片上的组织切片等杂交，与待测核酸的靶序列专一性结合，通过检测杂交位点荧光来显示特定核苷酸序列的存在、数目和定位。 六、重组体细胞的筛选纯化鉴定 * * * 产物 1.菌种 RRhPIZpQE-40 E．coli M15菌株 * 七、工程菌产物鉴定和保存 * 2.材料与试剂 DEAE-Sepharose FF(琼脂糖快流速阴离子交换剂)为杭州争光树脂有限公司产品,SephadexG-25为Sigma公司产品，Superdex75为GE公司产品,溶菌酶、脱氧核糖核酸酶、胰蛋白酶和羧肽酶B均为Sigma公司产品,谷胱甘肽[氧化型(GSSG)和还原型(GSH)]为上海博奥生物科技有限公司产品，二硫苏糖醇(DTY)为Organics Inc产品,13-巯基乙醇和异丙基-13-D-巯基吡喃半乳糖苷(IPTG)为BB1分装,胰蛋白胨、酵母粉（英国Oxiod公司）,氨苄青霉素（美国Sigma公司）,其余试剂均为国产分析纯产品。 * 七、工程菌产物鉴定和保存 * 培养基： （１）LB培养基(g/L):胰蛋白胨10.0,酵母提取物5.0,NaCl 10.0,pH 7.0; （２）发酵培养基(g/L):葡萄糖4,甘油15,酵母粉30,蛋白胨30,Na2HPO4 12,KH2PO4 6,NH4C l1,NaCl 2,MgSO4 0.48,pH 7.0; （３）甘油补料培养基(g/L):甘油300,酵母汁150,MgSO4 10,pH 7.0。所有培养基使用前均加入氨苄青霉素至终浓度50mg/L。水平恒温摇床（德国Therma公司）；Biostat　B发