基因治疗专业知识讲座课件.ppt

基因治疗专业知识讲座; 1972年T.Friedmann 和R. Roblin在Science上发表了题为“基因治疗人类的遗传病（Gene therapy for human geneticdisease）”的文章。 但鉴于体外重组技术刚刚问世，人们对“基因治疗”尚感到远不可及，因而未得到学术界的认可。 ;直到1989年美国NIH的R.M.Blase和W.F.Anderson提 出的“基因治疗重症联合免疫缺损（SCID）”临床方 案得到批准，并于1990年，他们用腺苷酸脱氨酶 (ADA)基因治疗了一例ADA基因缺陷导致SCID的4岁 女孩Evans，这是世界上第一例基因治疗临床试验， 2年后Evans血液内T细胞的数量接近正常水平，且 ADA基因表达良好，随之世界各国都掀起了研究基 因治疗的热潮，很多遗传病患者都满怀信心地接受 基因治疗。R.M.Blase和W.F.Anderson也被公认为是 基因治疗的先驱。 ;; 第一节．基因治疗的策略;;; 体细胞基因治疗的策略：;(4) 基因增效(gene augmentation)：将目的基因导入病变 细胞或其它细胞，目的基因的表达产物能修饰缺陷细胞的功能或使原有的某些功能得以加强。 (5) 基因干扰 ：也称基因失活，有两种干扰方法： ① 抑制有害基因：导入抑癌基因（TSG)来抑制癌基因的异常表达，但不能恢复癌基因的正常功能； ② 封闭有害基因：用反义RNA或小分子抑制RNA(siRNA) 来封闭癌基因基因，同样不能恢复癌基因的正常功能，但 可用来抑制病原体的关键基因。 (6) 免疫调节：将抗体、抗原或细胞因子的基因导入患者体内，改变患者免疫状态，达到预防和治疗疾病的目的。 (7) 药物敏感疗法：应用药物敏感基因转染肿瘤细胞，以提高其对药物的敏感性。;二、基因治疗的关键步骤基因治疗的关键包括以下三个方面： ①目的基因的选择； ②靶细胞的选择； ③选择安全而高效的方法和载体系统； 用于基因治疗的基因需满足以下几点; ①在体内仅有少量的表达就可显著改善症状； ②该基因的过度表达不会对机体造成危害； ③外源野生型目的基因具有适宜的受体细胞并能在体外有效表达； ④具有安全有效的转移载体和方法，以及可供利用的动物模型。;; 三、基因治疗的靶细胞选择 ; 四、体细胞基因治疗的途径;（一）?体外基因治疗 或ex vivo基因治疗：;;;（二）?? 体内基因治疗;第二节 基因转移的方法; 一、基因转移的非生物方法;（一）磷酸钙共沉淀法; （二）脂质体介导转染;（三）电穿孔法;（四） 直接注射法：;（五） 微粒子轰击法：;（六）受体介导的基因转移; 一般采用配体＋多聚赖氨酸（PL＋DNA）的 策略，如用脱唾液酸蛋白（asialoglyco- protein，ASGP）作为配体与PL连接可将反义 RNA带到肝中，这是因为肝细胞上有ASGP相 应的受体。;受体介导方法的优点： （1）是无感染能力； （2）可特异性转染靶细胞； （3）理论上不受DNA大小的限制； （4）构建灵活。 缺点： （1）转染效率低； （2）难以用于体内基因治疗； （3）可能有免疫原性； （4）只有短暂表达。; 二、基因转移的病毒方法;（一）反转录病毒载体;反转录病毒基因组大约10kb，含有三个最重 要的基因：gag（编码核心蛋白）、pol（编 码反转录酶）和env（编码病毒外膜蛋白）。 两端存在LTR 用于介导病毒的整合。 ;;;反转录病毒载体的优点是： （1）基因组小并且简单，能稳定地整合到宿主基因组的随机位点上； （2）能高效地感染宿主细胞，可将遗传信息传递给大量受体细胞，细胞感染率可达 100％； （3）侵染范围广，可侵染不同生物和细胞； （4）原病毒较稳定，且拷贝数低； （5）对宿主细胞无毒副作用； （6）可包装10kb外源DNA。;缺点是： （1）仅整合到处于分裂状态的细胞； （2）一些反转录病毒中存在原癌基因，其会 引起癌变的发生； （3）反转录病毒的LTR可致使细胞癌变； （4）常常只有短暂表达； （5）病毒滴度低（107pfu/ml）；插入容量有 限，不能插入较大的基因。; 2．构建重组反转录病毒载体;反转录病毒用作载体时需进行几步改造： （1）基本原则是用标记基因和外源基因替代 病毒的编码基因。 （2）制备包装细胞系，为载体DNA提供其丧 失的功能。 （3）将载体DNA导入包装细胞系以产生病毒 载体。 （4）病毒载体感染靶细胞，外源基因在细胞 内得以表达。 ;;;;;; 反转录病毒载体可分为以下几类： ①双