《生物化学》课件——分子生物学常用技术及应用 （人卫版）.pptVIP

分子生物学常用技术及应用 The Popular Technology in Molecular Biology: Principle and Application 第 一 节 基 因 工 程 (genetic engineering) 一、基本概念 DNA重组(DNA recombination ）： 不同来源的DNA分子可以通过磷酸二酯键连接形成重新组合的DNA分子，称为DNA重组 。 基因工程(genetic engineering) ： 将基因进行克隆，并利用克隆的基因表达、制备特定的蛋白或多肽产物，或定向改造细胞乃至生物个体的特性所用的方法及相关的工作统称为基因工程 。 二、工具酶 （一）限制性核酸内切酶 1.限制性核酸内切酶的概念 能够切割DNA多聚核苷酸链中磷酸二酯键的酶称为核酸酶，其中有选择地切割DNA分子特异序列的核酸酶，称为限制性核酸内切酶，简称限制性内切酶 。 2.限制性核酸内切酶的识别和切割位点 大部分限制性核酸内切酶识别的DNA序列具有回文结构特征，通常是4～6碱基对，大多数酶是错位切割双链DNA，产生5′磷酸基和3′羟基末端。 3种不同的情况： （1）产生3′突出粘性末端： （2）产生5′突出粘性末端：以PstⅠ为例 （3）产生平末端：NruⅠ为例 （二）其它工具酶 1.DNA连接酶 2.DNA聚合酶 3.逆转录酶 4.多核苷酸激酶 5.碱性磷酸酶 三、载体 载体的一般要求： ①能在宿主细胞中复制繁殖，并有较高的拷贝数； ②容易进入宿主细胞； ③具有多个限制性内切酶的单一酶切位点， 即为多克隆位点； ④容易从宿主细胞中分离纯化； ⑤有容易被识别筛选的标志 （一）质粒 (plasmid) 质粒(plasmid)是细菌中存在的独立于染色质以外的、能自主复制的、并与细菌或细胞共存的遗传成分。多为双链共价闭合环形DNA。 如pBR322质粒： 长度为4.3kb，含有氨苄青霉素（ampr）、卡那霉素（kanr）和四环素（tetr）的抗性基因 (二)噬菌体 (bacteriophage，phage) 噬菌体是感染细菌的一类病毒，因其寄生在细菌中并能溶解细菌细胞，所以称为噬菌体。 λ噬菌体 (三)粘粒（cosmid） 粘粒（cosmid）是将λ噬菌体的cos区与质粒组合的装配型载体。 质粒提供了复制的起始点、酶切位点、抗生素抗性基因，而cos区提供了粘粒重组外源DNA大片段后的包装基础。 表达载体(expressing vector)是用来在受体细胞中表达(转录和翻译)外源基因的载体。这类载体除具有克隆载体所具备的性质以外，还带有表达构件转录和翻译所必需的DNA序列。 四、重组DNA技术的基本过程 重组DNA技术的基本步骤： ①制备目的基因和相关载体； ②将目的基因和载体进行连接； ③将重组的DNA导入受体细胞； ④DNA重组体的筛选和鉴定； ⑤DNA重组体的扩增、表达和其它研究。 六、基因工程在医学中的应用 （一）医学基础的研究 （二）疾病的诊断和基因治疗 （三）基因工程药物 （四）转基因动物 （五）人类基因组计划