染色质免疫沉淀学习资料.ppt

酚/氯仿抽提步骤 按照1：1体积比加酚/氯仿充分混匀后离心，取上层水相至新管，加入1/10体积3M Nacl，2倍体积无水乙醇，大转数离心5min 5. 将超声处理过的样品在4℃ 13000rpm离心10分钟收集上清，10倍稀释，将其移入一新的2ml EP管中； 6. 按照每2ml稀释后液体加入75μl的比例加入蛋白A-琼脂糖/鲑精DNA (50%混悬液)，4℃摇动30分钟，预处理，短暂离心(700-1000rpm 4℃，小于1分钟)，收集上清液； ① Beads的选择 ② Input的设置 7. 向2ml上清液中加入适量的抗乙酰化组蛋白H3的抗体(20μl)，4℃摇动过夜，阴性对照组不加抗体同样摇动过夜； ① 抗体的选择 ② 对照的设置 二、免疫沉淀染色质DNA片段 Chromatin immunoprecipitation 基因型决定表型 破坏了基因型也就改变了表型 但是，也有一些无法解释的现象 在相应的基因碱基序列没有发生变化的情况下，一些生物体的表型却发生了改变。 什么是表观遗传学? 是DNA及其染色质环境的稳定改变，这些可遗传的变化并不涉及DNA序列的突变。 表观遗传修饰 在不影响DNA序列的情况下改变基因组的修饰，不仅可以影响个体的发育，而且还可以遗传下去。这类变异被称为“表观遗传修饰”，并被认为是导致遗传物质一致的孪生子出现个体差异的主要原因。 染色质重塑 染色质重塑在广义上是指染色质结构的动态调整或重新塑造染色质结构。在一些核内因子作用下，染色质DNA与其包绕的核心组蛋白之间亲和力的变化或相对位置的改变使得染色质结构变得较为松散，DNA更易于暴露。染色质重塑就是通过这样的变化来调控基因的转录。 在狭义上，染色质重塑专指由ATP提供能量的、通过依赖于ATP的染色质重塑复合物改变组蛋白与DNA的结合状态，在靠近核心组蛋白的DNA表面建立特殊的构象，使转录因子较易于接近DNA的过程。 染色质免疫沉淀技术的发展使染色质重塑研究得以进步 实验目的 学习掌握染色质免疫沉淀技术的基本原理与关键的操作步骤。 实验原理 实验流程 一、交联及染色质DNA剪切条件的优化 准备一瓶接近长满的HeLa细胞，向培养液中加入37%的甲醛至终浓度为1%，轻轻摇匀，在37℃孵育10分钟。 ① 甲醛的作用 ② 细胞的用量 ③ 交联条件对实验结果的影响 弃培养液，用预冷至4℃带蛋白酶抑制剂PMSF的1×PBS洗细胞两次，刮细胞到一个2ml离心管，2000rpm，4℃离心4min收集细胞。 甲醛的作用 在各种交联试剂中，甲醛（HCHO）的应用最为广泛。甲醛的浓度、作用时间及交联的温度等均可能影响交联的程度。甲醛可以通过赖氨酸、精氨酸和组氨酸以及那些DNA的氨基和亚氨基基团之间的交联，高效地在体内交联蛋白质-DNA、蛋白质-RNA以及蛋白质-蛋白质，形成生物复合体，防止细胞内组分的重新分布。除此之外，HCHO可以忠实地保留染色质结构，而且在温和条件下交联很容易逆转。通常交联所用的甲醛终浓度为1%，在12-37℃作用30min。但是如果反应温度超过30℃，本底就可能增加。因此，当必须在高温进行交联时，则应减少作用时间或甲醛浓度。过度交联将影响细胞的裂解，并且在超声处理时不能获得理想长度的DNA片段及影响DNA的溶解。对于特别容易进行交联的目的蛋白质（例如，组蛋白）需减少交联时间或甲醛浓度。甲醛的交联反应可被加入的甘氨酸终止。 细胞的用量 通常2.5×108细胞足够进行4次免疫沉淀。因此，一般为了保证用量，采取培养多瓶细胞，胰酶消化，收集在50ml离心管中，培养液重悬，计数。（一般分装1х107细胞于一个EP管，用于免疫沉淀反应）。 交联条件对实验结果的影响 对于不同的细胞类型，甲醛的浓度、交联的长度或者交联的温度都需要调整。如果交联不充分，会导致不完全固定，则DNA片段的平均长度会小于500bp。交联过度时细胞染色质难以用超声波破碎，就算延长超声波作用时间也会导致重要原料的丢失。交联时间如果过短，则交联不完全，产生假阴性，交联时间通常为5分钟到1个小时，具体时间根据实验而定。 3. 用500μl预热至室温带有蛋白酶抑制剂的SDS裂解液重悬并裂解细胞，冰浴10分钟； 超声波处理剪切染色质DNA，使其形成300-1000 bp即大约相当于2-5个核小体长度的片段； ① 超声条件对实验的影响及超声注意事项 ② 设置超声破碎的条件 ③ 酶消化与超声消化相比较的区别 ① 超声条件对实验的