提取紫杉醇初分离工艺的研究.pdf

紫杉醇（paclitaxel ，商品名Taxol ）是当今一种重要的抗癌新药。早在 1971 年，Wani 等 就从红豆杉树皮中发现并分离出了这种物质。由于它特异的临床抗癌疗效，1992年被美国FA D 批准为治疗晚期乳腺癌的特效药而上市。然而，在实际药物生产中，紫杉醇的大规模制备 仍 存在许多问题。首先，紫杉醇来源匮乏，其主要存在于红豆杉树皮和针叶中，其次，紫杉醇 在植物中含量极低，大约为 0.010%~0.013% ，而紫杉醇与其它紫杉烷化合物在化学结构和极 性 等方面又极为相似，要将它们完全分离困难很大。 　　关于紫杉醇提取分离方法，已有过不少的研究。其中以液-液萃取应用最为广泛，在文 献 报道的每一种工艺中，几乎都采用过它。Willey 等和 Mattina 等在测定样品中紫杉醇浓度时， 选择了固相萃取作为 HPLC 分析的预处理。以分子间吸附为机理的硅胶柱层析，是制备紫 杉醇 最常用的方法之一。1984 年，Senilh 等曾采用氧化铝柱层析处理红豆杉浸膏，但所报道的 分 离效果不是太理想。1995 年，Matysik 等曾用制备薄层层析来少量获取紫杉醇。本研究的目 的 ，在于寻找一条切实可行的工艺路线，最大程度地提高紫杉醇的回收率，以充分利用有限的 红豆杉资源；采用一些高效、经济的提取分离方法，减少过程步骤，快速、简捷地提取出紫 杉醇。 　　1 材料方法 　　1.1 材料 　　红豆杉树皮提取浸膏，云南张峰植物加工厂；紫杉醇对照品，纯度大于 95%，Sigma； 固 相萃取柱（C18 填料，10ml），大连化学物理研究所；GF254 硅胶和粗孔硅胶（100~140 目）， 青岛海洋化工厂；层析氧化铝（200~300 目），上海新诚精细化学品有限公司。 　　DU-7 紫外/可见分光光度计及 FL-750HPLC 仪，Beckman 公司；XZ-6A 旋转蒸发器，北 京科龙 仪器公司；常压层析系统，Pharmacia 公司。 　　1.2 方法 　　1.2.1 液-液萃取 称取红豆杉树皮浸膏于锥形瓶中，加 CH2Cl2 （浸膏CH2Cl2 的重量比 为 1：50 ），充分溶解，再加入与CH2Cl2 等量的水，充分混合后静置分层，分液回收有机相， 弃 水相。有机相再加水萃取，重复三次。将有机相中的 CH2Cl2 减压 蒸出回收，所得固相物 溶解 于甲醇中，用 HPLC 作定性定量分析。 　　1.2.2 固相萃取 固相萃取过程包括四个步骤，即固定相活化、样品上柱、淋洗、样品的 洗脱。全过程将速度稳定控制在 5~8ml/min 。固定相活化：取乙酸乙酯 10ml 加入柱中，抽 空。 依资助加入甲醇 10ml 和 0.01mol/L(pH5.0) 的乙酸铵缓冲液 10ml （乙酸铵水溶液），将液面维 持在胶层上 1~2mm。上样及淋洗：将样品溶于 80%~90%的甲醇乙酸铵溶液中，取0.5ml 加 入柱中 ，抽空。依次用0.01mol/L 的乙酸铵溶液 10ml、50%的甲醇乙酸铵溶液淋洗，抽空。紫杉醇 的 洗脱：在淋洗好的柱子中加入 80%的甲醇乙酸铵溶液 10ml，收集洗脱液，减压蒸发。从洗 脱液 蒸发所得的固体物中取样，溶解于甲醇，作 HPLC 定性定量分析。 　　1.2.3 硅胶柱层析 硅胶用 CHCl2 浸泡，超声波脱气 5min，重力沉降法装柱（15mm-×260 mm ），用CHCl2 充分洗出硅胶中的杂质至柱床透明。样品溶解于 CHCl3 后上柱，再用 CHCl3 充分 洗去未被吸附的杂质，然后用 3 ：97 （v/v ）的CH3OH ：CHCl3 进一步洗脱，收集洗脱峰， HPLC 测定紫杉醇的浓度和纯度。柱层析过程在常温常压下操作。 　　1.2.4 氧化铝柱层析 CH3OH 、CHCl3 用分子筛脱水，层析用氧化铝 190℃真空干燥 6h 后， 用脱水 CHCl3 浸泡，超声波脱气 5min，装成 15mm×260mm 的层析柱。清洗柱后上样，用 CHCl3 洗 去未被吸附的杂质，再用 1%的CH3OH、CHCl3 （v/v ）淋洗，最后用5%的CH3OH 溶液洗 脱出紫杉 醇。HPLC 测定其纯度，柱层析过程在常温常压下操作。 　　1.2.5 制备薄层层析 用 GF254 硅胶自制 100mm×200mm 层析薄板，105℃活化 0.5h ，样 品用 CH3OH 溶解，配成 10mg/ml 的溶液。毛细管点样，成线状，每板点样量在2mg 左右。在对 照板中 点标准品和样