微生物发酵制药宝典-第十章制药微生物菌种建立.ppt

第二篇 生物技术制药工艺 第十章 微生物发酵制药工艺 10.1 概述 10.2 微生物生长与生产的关系 10.3 制药微生物菌种建立 10.4 制药微生物培养基制备 10.5 灭菌工艺 10.6 微生物发酵培养技术 10.7 发酵工艺过程的检测与控制 10.3 制药微菌种的建立 10.3.1 新药生产菌种的选育 10.3.2 菌种保藏 10.3.3 菌种库建立与质量控制 制药生产对菌种的要求 1.遗传稳定性：能长期繁殖，不易变异和退化。纯种，无杂菌及噬菌体。 2.易生长性：生长旺盛、迅速； 4.容易培养性：条件易控，利用价廉易得的原料。 3.抗污染性：自身保护机制，抵抗杂菌污染能力强。 4.经济性：发酵周期短，产量高，良好经济能力。 5.突变敏感性：对各种诱变较敏感，提高的潜力大。 自然分离 目的：出发菌的获取 样品的采集：大陆表层土壤，海洋水体 预处理：根据分离目的和微生物的特性。 温度；化学处理；离心、膜过滤 培养基：选择性，营养和pH；添加抑制剂。 分离方法： （1）稀释法：无菌水，生理盐水，缓冲液 （2）滤膜法：细菌在膜上，放线菌进入培养基。 培养条件：温度。放线菌：25－30℃，32－37℃，45－50℃；7－14天至1月。 药物的筛选 琼脂扩散法——活性测定： 非致病菌为对象，筛选生物活性物质。 耐药和超敏菌种。 HPLC、LC－MS等，分析鉴定活性物质。 靶向筛选 高通量筛选 高内涵筛选 生产选育 概念：不经过人工诱变处理，根据菌种的自然突变而进行的菌种筛选过程。 应用： （1）菌种的提纯复壮。（2）防止退化，稳定生产水平。1年1次。 过程 诱变育种 概念：人为创造条件（诱变剂处理），使菌种发生变异，筛选优良个体，淘汰劣质个体。 物理类：紫外线，快中子，激光，太空射线。 化学类：碱基类似物，嵌合剂，亚硝酸。 生物类：噬菌体，转座子。 诱变方案设计 出发菌种的选择：较高产，对诱变剂敏感。 诱变剂的使用：交叉使用多种，合理组合。中等剂量（80％致死率）。 选择压：施加一定的选择压，获得耐药菌株。措施：添加抗生素，提高前体浓度，增加产物浓度。 诱变育种流程 原生质体融合育种 概念 通过化学或物理学的方法，使两个不同种类的体细胞融合在一起，形成杂合细胞，产生兼具两个亲本遗传性状的新细胞。 特点：有一定的定向性，效果显著。 基因组Shuffling过程 突变：随机突变获得单个性状优良的菌株 重组：多个菌株的原生质体混合、融合、再生，形成第一个融合库（F1） 筛选鉴定：获得有益突变积累的新性状菌株 多轮循环：再次融合，得到融合库F2、F3、F4……., 筛选鉴定…… 结果：消除有害突变，组合有益突变新菌种 生长曲线(选择压2.5M) 10.3.2 菌种保藏 原因：菌种经过多次传代，会发生遗传变异，导致退化，从而丧失生产能力甚至菌株死亡。 目的：保持菌种原有优良特性，延长生命时限，长期存活、不退化，不污染，随时为生产供菌。 原理：使菌种代谢处于不活跃状态，即生长繁殖受抑制的休眠状态。 措施：物理和化学方法（温度：低温；水分：干燥；氧气：缺氧；营养；缺乏） 10.3.3 菌种库建立与质量控制 依据： GMP对药品生产的有关要求和规定 建立各级种子细胞库，实施种子批系统管理，进行验证 确保菌种的稳定、无污染，保证生产正常有序进行。 建库的流程 菌种库的质量管理 保藏机构－中国 中国典型培养物保藏中心:China Center for Type Culture Collection (CCTCC)。 中国科学院典型培养物保藏委员会,下设9个库 中国普通微生物菌种保藏管理中心：China General Microbiological Culture Collection Center (CGMCC)，微生物所（真菌和细菌）；武汉所（病毒） 抗生素菌种保藏管理中心（CACC）：中国医学科学院抗生素所，四川抗生素所，华北制药集团抗生素所 保藏机构－国外 WFCC：World federation for culture collections, http://www.wdcm.riken.go.jp/wfcc.thml 美国的典型菌种保藏中心ATCC: American Type Culture Collection, / 日本发酵研究所IFO: Institute for Fermentation, Osaka, Japan 英国国家典型菌种保藏所NCTC: National Collection of Type Culture, London, UK 小结与要求 生产菌种选育：自然分离获得出发菌种，生产选育、诱变和原生质体融合、Shuffling，提高菌种生产性能 菌种保藏：防止失