博士学位论文预答辩课件.ppt

* 将上一步骤中COOH终止的硅片表面活化，再与单链DNA反应，就可以将DNA接在表面． 用单链修饰的表面与匹配的序列反应，就可以形成双链DNA。 我们的基底制备方法和探针分子固定方法为下一步检测提供了可靠的基础。 * 接下来我将要向大家介绍利用前面提到的设计思想，在基片上进行的检测工作。 我将此检测方法应用在两个方面。 第一是利用发卡分子开关前后的构型变化，通过交流阻抗测量修饰电极的介电常数的变化。--正是在这一部分的工作中，我们发现了发卡型探针设计和电势控制的重要作用。 另一方面是利用一类被成为镶嵌式染料分子，它只对双链DNA有很强信号，对于单链DNA信号非常低。 这类染料分子不用事先对DNA序列进行标记，只需在测量时加入即可。测量发卡分子开关前后的荧光信号变化，即可以进行识别工作。 * 先介绍利用交流阻抗法检测杂交过程。 由于我们着力发展无标记的检测方法，而DNA杂交前后会伴随着质量、构象、表面电荷密度等多项参数的变化，因此无需标记就可以获得这些性质。 而这些参数的变化都将直接影响我们测量的膜的电容值。 传统的电化学方法检测往往只是检测电流-电压的响应曲线，这对于DNA这一复杂体系来说信号较难分析，大多数情况都需要引入电活性物质进行标记。 我们的研究工作中利用交流阻抗检测杂交前后的电容变化，比较灵敏而且方便，可以做到实时检测。 * 当我们有了交流阻抗这个想法后，首先来考察一下这种检测方法的可行性。 我们将单链DNA修饰的表面作为电极，往测量体系中加入不匹配和完全匹配的DNA序列，测量电容的变化。 通过反复地杂交、洗涤、再杂交，实验结果都表现出只对匹配序列响应，而对非匹配序列（不是点错配序列）不响应，不但非常灵敏，特异性好，并且重复性强。 因此，下一步我们就将前面提到的两点设计思想应用到电容检测上。 * 首先要设计出合理的发卡型结构DNA序列。 在这一实验中，我们选择了肿瘤抑制基因p53序列的片断。临床检测发现，大约有20%-60%的肿瘤患者中都存在有p53基因的突变。 从数据库的搜索中我们发现，位于第7个外显子上的密码子248发生突变的几率最高。因此我们选择了包含codon 248这一段序列作为研究对象。 将与这段序列配对的链作为探针发卡分子的环，另外经过软件计算选择合适的茎秆部分。解释发卡结构的形成 * 为了进行对比，我们设计了几种结构不同的探针分子。 首先是比较发卡结构和线性结构的探针的差别。 其次是比较不同茎秆设计的影响。Probe3和Probe4相比，差异在于4的茎秆部分比3的少一个碱基对，只有5个。可以想像，探针3形成的发卡分子比探针4形成的发卡分子更难打开。 * 如果我们用DNA双链的解链温度来描述结构的稳定性，用这样一个选律来表征设计的合理性，也就是说，全匹配序列WT形成的结构最稳定，其次是未杂交的状态Pc，最不稳定的是有单点错配杂交形成的结构MT。可以清楚的看到，第4类探针分子的设计是最为合理的，满足我们设计思想的第一个环节。 * 将设计好的探针分子固定在硅基底上，测量他们的Mott-Schottky图，可以看到单点错配链杂交后的信号基本上和未杂交单链的信号相同，而完全匹配的链可以明显的与他们区分开来。 进一步观察，他们的电容在不同电压下的差别不同。较正的电压下区别较小，较负的电压下区别较大。这就启发我们，利用电压的改变来控制整个识别过程。 * 于是我们设计了一个杂交反应实时检测的装置来观察电势控制的影响。 我们通过一个微量进样器，把DNA序列加到检测体系中实时检测。 * 我们实验的结果与我们的设计符合很好。--充分说明了电势控制的重要性。 图中箭头指示的是单点错配序列和全匹配序列的加入。 在较正的电压下，修饰电极对种序列有几乎相同的响应，但是电势的负移使二者的区别增加。在较负的电压是，电极已经基本对单点错配序列没有信号响应，但是却仍然可以对全匹配序列响应，证明杂交过程的发生。 这其实并不难理解，在较正的电压有利于中和DNA链所带的负电，因此有利于双链形成。这时单点错配序列和完全匹配序列不会有太大的差别。随着电压负移，就会导致双链的解开。由于单点错配序列上存在的缺陷，将使他的稳定性低于完全匹配的序列，因此差别变大。 这种电势控制的方法非常简单，检测速度也很快。 * 现在让我们来比较一下4种不同设计的探针分子对单点错配序列和全匹配序列的区分能力如何。 首先我们可以发现，线性结构的分子基本无法区分两类序列。茎秆部分太长的序列也因为较难打开，区分度也较差。 设计最为合理的第4类发卡型探针分子的区分度最好。 * 以上是对交流阻抗测量杂交过程的总结。 我们可以清楚的看到，设计思想中发卡结构的仔细计算设计，和电位控制这两方面缺一不可。 忽略任何一个方面都会导致区分度下降。 * 交流阻抗的方法已经被证明可以成功的分