分子生物学实验技术讲义.doc

硕士研究生用 分子生物学实验技术 高建明 天津农学院农学系 作物遗传育种重点实验室 2013年3月 目 录 实验一DNA的琼脂糖凝胶电泳 (1 实验二动物、植物基因组DNA的提取与定量 (4 实验三DNA的酶切与检测 (8 实验四聚合酶链式反应(PCR优化 (11 实验五DNA的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 (15 附录I 常用溶液配制 (17 实验一 DNA的琼脂糖凝胶电泳 一 实验目的 掌握琼脂糖凝胶电泳的原理与操作方法。 二 实验原理 琼脂糖(agarose是由半乳糖及其衍生物构成的中性物质,常作为电泳支持物。以琼脂糖凝胶为支持介质的电泳已广泛应用于核酸研究中,为DNA分子的相对分子量(Mr测定和分子构象的分析提供了重要手段。琼脂糖凝胶电泳具有操作方便,设备简单,需样品量少及电泳速度快等优点。 DNA在pH高于其等电点的溶液(碱性溶液中带负电荷,在电场作用下朝正极移动。DNA在电场中通过凝胶介质而泳动,除电荷效应外,凝胶介质还有分子筛效应,与分子大小和构象有关。由于不同的DNA分子的Mr与构象不同,因而电泳后呈现迁移位置的差异。不同大小的DNA需要用不同浓度的琼脂糖凝胶进行电泳分离(表6-1。此外,Mr相同但构型不同DNA分子的移动速度不同,共价闭环DNA(covalently closed circular,cccDNA最快,线性DNA次之,而开环的双链环状DNA最慢。当琼脂糖浓度太高时,环状DNA(一般为球形不能进入胶中,相对迁移率为0,而同等大小的直线双链DNA(刚性棒状则可以长轴方向前进。 表2-1 DNA在琼脂糖凝胶中的有效分离范围 琼脂糖浓度(%0.3 0.6 0.7 0.9 1.2 1.5 2.0 线状DNA相对 60-5 20-1 10-0.87-0.56-0.43-0.2 2-0.1 分子质量(kb 溴化乙锭可按比例插入到DNA分子双链的配对碱基之间,在紫外光的照射下,插入溴化乙锭的DNA呈橙红色荧光,其强度比游离的溴化乙锭发出的荧光强度大10倍,所以溴化乙锭可以作为指示剂指示DNA的含量(检测限为25 ng和位置。将DNA样品与分子量标准同时电泳,可测定DNA样品的Mr,而将DNA 样品与浓度已知的相同分子量大小的DNA片段同时电泳,便可对样品DNA进行定量。 电泳过程中,常使用一种有颜色的标记物以指示样品的迁移过程,核酸电泳常用的指示剂有两种:溴酚兰和二甲苯青,分别呈蓝紫色和蓝色。在0.6%、1%、1.4%和2%琼脂糖凝胶电泳中,溴酚兰的迁移率分别与1 kb、0.6 kb、0.2 kb和0.15 kb的双链线性DNA片段大致相同。二甲苯青在1%和1.4%琼脂糖中电泳时,其迁移速率分别与2 kb和1.6 kb的双链线性DNA大致相似,迁移速度只有溴酚兰的约50%。 用于分离核酸的琼脂糖凝胶电泳可分为垂直型及水平型。由于水平型凝胶具有制胶和加样方便的优点,因而使用更多。水平型电泳时,凝胶板完全浸泡在电极缓冲液下1-2 mm,故又称为潜水式。 三 实验材料 基因组DNA。 四 实验仪器及用具 移液器、电泳仪、电泳槽、制胶架、微波炉、凝胶成像仪、三角瓶、Parafilm 膜等。 五 药品和试剂 5×TBE、6×加样缓冲液(0.25%溴酚蓝,0.25%二甲苯青,40%蔗糖、10 mg/ml 溴化乙锭(20000×EB,工作浓度为0.5 μg/ml、20 ng/μl λ-DNA、琼脂糖等。 六 实验步骤 1.琼脂糖凝胶的制备 (1将制胶模放在工作台的水平位置上,在距离底板0.5-1.0 mm的位置上放置梳子,以便加入琼脂糖后可以形成完好的加样孔。如果梳子距离玻璃板太近,则拔出梳子时孔底有破裂的危险,最后导致样品渗漏。 (2配制1%浓度的凝胶。在电泳缓冲液(1×TAE中加入琼脂糖,在沸水浴或微波炉中将悬浮液加热至琼脂糖彻底溶解。 (3使溶液冷却至60℃,加入溴化乙锭,迅速充分混匀后倒入胶膜中,检查梳子的齿下或齿间是否有气泡,如有则马上清除。 (4在凝胶完全凝固后(大约需要40分钟,小心移去梳子,将凝胶放入电泳槽中。 (5在电泳槽中加入没过胶面1 mm以上的电泳缓冲液。 注意:缓冲液中缺少离子时,电流太小,DNA迁移慢;相反,高离子强度的缓冲液由于电流太大会大量产热,严重时,会造成胶熔化和DNA的变性。 2.加样与电泳 (1将一定量的DNA样品与加样缓冲液在Parafilm膜上或离心管中按5﹕1混匀(一般DNA样品最好控制在0.05~0.25 μg之间。 (2用微量取液器先将λ-DNA标准溶液加入加样孔中,然后将DNA样品混合液依次加入同一排相邻的加样孔中。加样完成后通电(电压按照两极间距离2-4 V/cm计算。 (3当溴酚蓝在凝胶中迁移出适当的距离时(一般为3-5cm,切断电流,在紫外灯下观察并照相。 七 实验作业 D