实验九、蛋白质两性性质及等电点的测定.docxVIP

实验九、蛋白质两性性质及等电点的测定 1、目的要求 （1）了解蛋白质的两性性质。 （2）掌握通过聚沉测定蛋白质等电点的方法。 2、实验原理 蛋白质是两性电解质。蛋白质分子中可以解离的基团除N端α―氨基与C端α―羧基外，还有肽链上某些氨基酸残基的侧链基团，如酚基、巯基、胍基、咪唑基等基团，它们都能解离为带电基团。因此，在蛋白质溶液中存在着下列平衡： 阳离子 两性离子 阴离子 pH < pI pH = pI pH > pI 电场中：移向阴极不移动移向阳极调节溶液的pH使蛋白质分子的酸性解离与碱性解离相等，即所带正负电荷相等，净电荷为零，此时溶液的pH值称为蛋白质的等电点。在等电点时，蛋白质溶解度最小，溶液的混浊度最大，配制不同pH的缓冲液，观察蛋白质在这些缓冲液中的溶解情况即可确定蛋白质的等电点。 3、试剂和器材 一、试剂 1mol/L乙酸：吸取99.5%乙酸（比重1.05）2.875mL，加水至50mL。 0.1mol/L乙酸：吸取1mol/L乙酸5mL，加水至50mL。 0.01mol/L乙酸：吸取0.1mol/L乙酸5mL，加水至50mL。 0.2mol/L NaOH：称取NaOH2.000g，加水至50mL，配成1mol/L NaOH。然后量取1mol/L NaOH 10mL，加水至50mL, 配成0.2mol/L NaOH。 0.2mol/L HCl：吸取37.2%（比重1.19）HCl 4.17mL，加水至50mL，配成1mol/L HCl。然后吸取1mol/L HCl 10mL，加水至50mL，配成0.2mol/L HCl。 0.01%溴甲酚绿指示剂：称取溴甲酚绿0.005g，加0.29mL 1mol/L NaOH，然后加水至50mL。 二、测试样品 0.5%酪蛋白溶液：称取酪蛋白（干酪素）0.25g放入50mL容量瓶中，加入约20mL水，再准确加入1mol/L NaOH 5mL，当酪蛋白溶解后，准确加入1mol/L乙酸5mL，最后加水稀释定容至50mL，充分摇匀。 三、器材 试管1.5×15cm（×8）；移液管1mL（×4），2mL（×4），10mL（×2）；胶头滴管（×2）。 4、操作方法? 一、蛋白质的两性反应 （1）取一支试管，加0.5%酪蛋白1mL，再加溴甲酚绿指示剂4滴，摇匀。此时溶液呈蓝色，无沉淀生成。 （2）用胶头滴管慢慢加入0.2mol/L HCl，边加边摇，直到有大量的沉淀生成。此时溶液的pH值接近酪蛋白的等电点。观察溶液颜色的变化。 （3）继续滴加0.2mol/L HCl，沉淀会逐渐减少以至消失。观察此时溶液颜色的变化。 （4）滴加0.2mol/L NaOH 进行中和，沉淀又出现。继续滴加0.2mol/L NaOH，沉淀又逐渐消失。观察溶液颜色的变化。 二、酪蛋白等电点的测定 （1）取同样规格的试管7支，按下表精确地加入下列试剂： 试剂（mL） 管号 1 2 3 4 5 6 7 1.0mol/L 乙酸 1.6 0.8 0 0 0 0 0 0.1mol/L 乙酸 0 0 4 1 0 0 0 0.01mol/L 乙酸 0 0 0 0 2.5 1.25 0.62 H2O 2.4 3.2 0 3 1.5 2.75 3.38 溶液的pH 3.5 3.8 4.1 4.7 5.3 5.6 5.9 混浊度 ? ? ? ? ? ? ? （2）充分摇匀，然后向以上各试管依次加入0.5%酪蛋白1mL，边加边摇，摇匀后静置5min，观察各管的混浊度。 （3）用-、+、++、+++等符号表示各管的混浊度。根据混浊度判断酪蛋白的等电点。最混浊的一管的pH值即为酪蛋白的等电点。 5、注意事项 在测定等电点的实验中，要求各种试剂的浓度和加入量相当准确。 6、思考题 1．该方法测定蛋白质等电点的原理是什么？ 2．解释蛋白质两性反应中颜色及沉淀变化的原因。