吉大农学部09生计工程复习资料(附答案) (1).docVIP

1、目前常用的转基因方法有哪些，各有何特点？ 转化方法 农杆菌法 PEG法 电击法 微针注射法 基因枪法 花粉管通道法 受体材料 完整细胞 原生质体 原生质体 原生质体 完整细胞 卵细胞 宿主范围 有 无 无 无 无 有性繁殖植物 组培条件 简单 复杂 复杂 复杂 简单 无 嵌合体比例 有 无 无 无 多 无 操作复杂性 简单 简单 复杂 复杂 复杂 简单 设备要求 便宜 便宜 昂贵 昂贵 昂贵 便宜 工作效率 高 低 低 低 高 低 单子叶植物应用 少 可行 可行 可行 广泛 广泛 1、农杆菌介导法是目前双子叶植物基因转移的常用方法。 2、PEG法： 3、电击法：此法在动物细胞中应用较早并取得很好效果，现在这一方法已被广泛用于各种单、双子叶植物中，特别是在禾谷类作物中更有发展潜力。 4、微针注射法：显微注射的一个重要问题是必须把受体细胞进行固定。 转化的成功率高 可以省去选择性标记的麻烦 5、基因枪法：是继农杆菌介导法之后的第二大基因转化法。 在禾本科作物上应用较广泛。 基因枪法转化的优缺点： 无宿主限制：农杆菌介导法只对双子叶植物敏感，限制了它的应用范围。而基因枪没有物种限制。 靶受体类型广泛：可以是原生质体，叶片，悬浮细胞，茎或根切段，种子胚，愈伤组织，花粉等。 操作简单快速 但该方法转化率低，外源DNA整合机理不清楚。应该说该技术只处在研究阶段，尚未成熟。 6、花粉管通道法：优点：利用整体植株的卵细胞、受精卵或早期胚细胞转化DNA，无需细胞、原生质体等组织培养和诱导再生植株等一套人工培养过程。方法简便；单、双子叶植物均可应用；育种时间短。 缺点：这一技术局限欲开花时间才能应用；对DNA大小纯度要求高。 2、植物转基因受体材料有哪些？试述选择受体细胞的原则。 原则： 据所用载体体系及受体细胞的基因型进行选择； 重组体的转化或转染率高； 能够稳定遗传； 受体细胞基因型与载体所含的选择标记匹配； 易于筛选重组体； 外源基因可以高效表达和稳定遗传； 此外，安全性、导入方法、翻译及后加工机制和生产应用价值等。 受体材料类型：（1）微生物表达系统（是较为理想的受体细胞） 常用微生物表达系统：大肠杆菌、枯草杆菌、蓝细菌、棒状杆菌和链霉菌、酵母菌 （2）植物表达系统： 常用的受体材料有以下几大类型:愈伤组织再生系统、直接分化再生系统、原生质体再生系统、胚状体再生系统、生殖细胞受体系统 3、重组子的筛选和鉴定方法 一、载体表型选择法 （一）、抗药性标记及其插入失活选择法 1. 原理：pBR322质粒上有两个抗菌素抗性基因: Tetr和Ampr。 Tetr上有插入位点BamH I和Sal I; Ampr上有插入位点Pst I。 2. pBR322抗菌素标记选择 （1）四环素：抑制细菌生长，但不杀死细菌。 （2）氨苄青霉素抗性基因：产生b-内酰胺酶，使氨苄青霉素转变为青霉酮酸，使碘-青霉素指示液（I2-KI-Aampicillin）（蓝灰色）褪色。 （3）环丝氨酸：杀死生长的细菌，但不杀死停止生长的细菌。 3. 选择过程： （1）四环素抗性插入失活 如果在Tetr上插入外源DNA，导致四环素抗性基因失活，可用四环素加环丝氨酸平板培养基选择重组克隆。 Tetr失活的菌生长被四环素抑制，不被环丝氨酸杀死，保留下来； Tetr不失活的菌抗四环素，能分裂生长，反而被环丝氨酸杀死。 （2）氨苄青霉素抗性插入失活选择过程 如果Ampr上插入外源DNA，导致氨苄青霉素抗性基因失活，可用碘-青霉素指示液选择。 （二）b-半乳糖苷酶显色反应选择法 1、原理见简答 2、. 选择过程 见简答 二、根据插入基因的表型选择：利用插入的外源基因的表达产物特性进行直接选择。（只在特定条件下）。 （一）原理： 1.弥补缺陷：转化进来的外源基因产物能够弥补受体菌株的突变型缺陷。 2. 增加新性状：使被转化的受体菌表现出外源基因的表型。 三、DNA电泳检测法 ：利用有插入片段的重组载体的分子量比野生型载体分子量大。 （一）直接电泳检测法：从转化后的菌体克隆中分离质粒，电泳、比较其分子量。 （二）酶切电泳筛选法 1. 原理：根据已知的外源DNA序列的限制性酶切图谱，选择一两种内切酶切割质粒，电泳后比较电泳结果（DNA带数和长度）。或用合适的内切酶切下插入片断，再用其它酶切这个片断，电泳后比较结果是否符合预计的结果。 （三）PCR扩增检测法 1. 原理：PCR能在模板序列上扩增出预期DNA片断。 2. 过程：从重组克隆中提取质粒（或DNA），用外源DNA插入片断引物作PCR，电泳PCR产物，检查是否有PCR产物，PCR产物的长度是否与外源基因一致。 （四）核酸杂交检测法 1. Southern blotting ：用DNA（或