宏基因组的构建及应用.pptxVIP

快速有效筛选目标微生物的新方法 —宏基因组的构建及应用;宏基因组学 ;第一节 什么是宏基因组学;宏基因组(the genomes of the total micro biota found in nature)是指生境中全部微生物基因的总和。它包含了可培养的和未培养的微生物的基因总和，微生物主要包括环境样品中的细菌和真菌。;第二节 宏基因组学技术流程;一、环境样品DNA提取 提取步骤通常需要满足两个条件： ①尽可能提取样品所有微生物的基因， ②保持片段的完整和纯度。 目前所开发的DNA提取方法有两种： 细胞提取法和直接裂解法;直接裂解法：物理法：冻融法、超声法、玻璃球珠击打法、液氮碾磨法 化学法：常用化学试剂有表面活性剂、盐类、有机溶剂等 酶裂解法; 1、原位裂解法（直接提取法） 原位裂解法是在环境样品中加入DNA提取缓冲液，使细胞裂解然后从样品中直接提取DNA并纯化的方法。 优缺点：该法提取的DNA产量较高，操作容易、成本低，但纯度低，腐植酸等污染严重，往往还需要经过纯化处理才能满足后续分子生物学操作的需要，此外，由于机械剪切作用较强，提得的DNA片段长度有限（1-50Kb），常适用于构建小片段插人文库(以质粒和噬菌体为载体)的DNA提取。 ;2、异位裂解法; ;1、载体系统选择 常用的克隆载体有: 质粒载体(如pUC18和pUC19)，插入片段一般小于10 kb； Cosmid(黏粒载体，如pWE15)，插入片段30～45kb； BAC(细菌人工染色体，如pBeloBAC11)，插入片段大于100kb。 ;选择合适的载体系统，应考虑以下因素 : 所提DNA的质量及研究目的，包括欲插入目的片段的大小、所需要的载体拷贝数、使用的宿主以及筛选方法等。 如对腐殖质含量较高或剪切较严重的DNA样品适宜构建质粒文库，小片段的文库适用于筛选新的与代谢相关的单基因或小操纵子。而对于含较大基因簇或大片段的DNA样品则适宜构建Cosmid、Fosmid或BAC文库，从而筛选由较大基因簇编码的复杂代谢途径或能够表征环境中未培养微生物基因组的较大基因片段。 ; 2、宿主系统选择 宿主菌株的选择主要考虑： 转化效率，重组载体在宿主细胞中的稳定性，宿主能否为相关功能基因提供必需的转录表达体系，对异???表达基因产物提供必需的转录表达体系，对异源表达基因产物是否有较强的相容性，以及目标性状(如抗菌性)及缺陷型等因素。 研究表明，不同微生物种类所产生的活性物质有明显差异，不同的研究目标应选择不同的宿主菌株。鉴于7O% 的抗生素来源于放线菌的事实，若以寻找抗菌、抗肿瘤活性物质为目标，选择链霉菌为宿主较理想；而筛选新的酶则采用大肠杆菌为宜。;3、转化 在宏基因组克隆中，所谓转化是指通过适当的方法使宿主细胞处于感受态，从而摄取重组DNA的水平方向的基因转移过程。 其方法有CaC12法和电穿孔法。 CaC12法即用高浓度的Ca2+诱导细胞使其成为能摄取外源DNA 的感受状态，该方法自建立以来已广泛用于以大肠杆菌为受体的重组质粒的转化，但该方法转化效率不高。 电穿孔法是用高压脉冲电流击破宿主细胞膜或击成小孔，从而使外源DNA由小孔进入细胞，该方法转化效率较高。;三、宏基因组文库筛选;1 功能驱动的筛选 功能驱动的筛选(Function-driven screening)即基于活性的筛选。是根据重组克隆产生的新活性而进行筛选的方法。 优点：只要基因能在宿主中表达，就可以根据基因表达特性进行筛选，能迅速找到可用于工农业和医药业的酶等蛋白质和抗生素等天然??物； 缺点：目的基因必须能在宿主中进行功能表达，而基因表达与否除了和宿主有关外，还决定于基因本身的完整性，这就要求一方面要选择合适的宿主菌株，另一方面要求克隆到基因或基因簇的全长，一旦克隆过程中基因的某个组件遭到破坏将使基因无法表达，也就不能根据表型加以筛选。筛选工作量大、效率低。;2 化合物结构水平的筛选 化合物结构水平的筛选(Screening on compound structure)是根据不同结构的物质在色谱中有不同的吸收峰值，通过比较转入和未转入外源基因的宿主细胞或发酵液抽提物的色谱图，筛选产生新结构化合物的克隆子。 这一方法可直接筛选到新结构化合物，但不一定有生物活性，且工作量大、成本高。;3 序列驱动的筛选 序列驱动的筛选(Sequence-driven screening)是根据已知功能的基因序列设计探针或PCR引物，通过核酸杂交或PCR扩增来筛选具有目标序列的克隆子。 优点：不依赖克隆基因在宿主菌株中的表达。 缺点：必须对相关基因序列有所了解，无法筛选宏基因组文库中那些和现有基因序列完全不同的新基因(即未知基因)。;PS