七金氏法测定血清谷丙转氨酶活性参考幻灯片.ppt

实验七 金氏法测定血清谷丙转氨酶活性 1 3. 了解测定血清谷丙转氨酶活性的临床意义 1 . 掌握金氏法测定血清谷丙转氨酶活性的原理 2. 熟悉血清谷丙转氨酶活性测定具体操作方法 2 将α - 氨基酸的氨基通过酶促作用 转移 到α - 酮基上，生成相应的 酮酸 与 氨基酸 的反应。催化这一反应的酶称为 转氨酶。 转氨作用： 3 也称氨基转移酶，是一组催化 氨基 在 ? - 氨基酸 与 ? - 酮酸 之间转移的酶 。 是一种 细胞内酶 ，当细胞膜通透性增加或细胞 死亡时释放到血液中。 转氨酶 4 转氨酶 广泛存在于机体的各种组织中。 在肝、心、肾等组织中， 谷丙转氨酶 （ GPT ）和 谷草转氨酶 （ GOT ）的活性 均较高。在正常的新陈代谢过程中， 血清内两种酶维持一定水平的转氨酶 活性（即正常值）。 5 转氨作用的机制： 6 体内主要两 种转氨酶？ 谷丙转氨 酶 （ GPT ） 又称丙氨 酸转氨酶 （ ALT ） 谷草转氨 酶 （ GOT ） 又称天冬 氨酸转氨 酶（ AST ） 肝脏 心脏 7 谷丙转氨酶 ： 催化谷氨酸和丙氨酸之间的转化 的转氨酶，其结构式反应如下： 8 血清谷丙转氨 酶活性 测定的临床意义 谷丙转氨酶 广泛存在于机体各组织中。正常人 血清中此酶浓度活性很低，肝细胞中该酶浓度活 性极高，当肝细胞受损时此酶从细胞中释放血。 因此测定血清 ALT 活性对于某些疾病的诊断和预 后判断具有重要的参考价值。 （ 1 ） 血清 ALT 活性增高： 肝胆疾病 、 药物和毒物 （ 2 ） ALT 活性降低 ： 磷酸吡哆醛缺乏症 。 ALT 在临床上主要用于肝脏疾病的诊断 9 酶活性 ：是指在规定条件下，单位时 间内 底物的减少量 或 产物的生成量 。即酶反 应速度。 酶活性的 影响因素 样品处理 测定条件 溶血 抗凝剂 存放时间 温度 pH 时间 底物浓度 酶浓度 10 常用的谷丙转氨酶酶活性测定方法有： 1 金氏法（ King 法） 2 赖氏法（ Mohun 法） 3 改良穆氏法（ Reitman-Frankel 法） 共同点 ：原理、试剂、操作步骤和作用时间相似。 不同点 ：在于单位定义和标准曲线绘制方法不同， 因此测定结果的单位数值不同。 在 37 ℃ ,1ml 血清与底物作用 60min ， 生成 1 μ mol 丙酮酸为 1 个活性单位 11 第一步反应 ： 12 第二步反应： 520nm CH 3 α - 丙酮酸 13 2 标准曲线的制备 1 测定酶活性 14 试剂 试管编号 测定管 对照管 丙氨酸氨基转移 酶底物液（ ml ） 0.5 0.5 置于 37 ℃ 水浴中预温 5min 血清（ ml ） 0.1 置于 37 ℃ 水浴 60min —— 2,4 一二硝基苯肼 溶液（ ml ） 0.5 0.5 血清（ ml ） —— 0.1 各管混匀后，置于 37 ℃ 水浴中保温 20min 0.4 mol/L NaOH 溶液（ ml ） 5.0 5.0 混匀， 10min 后， 30min 内在 520nm 处比色，以对照管调零，读取测定管吸光度值。 1 测定酶活性 取试管 2 支，按下表 3-13 操作 表 3-13 15 试剂 试管编号 1 2 3 4 5 6 2 μmol /L 丙酮酸标准液 （ ml ） —— 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 谷丙转氨酶底物液（ ml ） 0.50 0.45 0.40 0.35 0.30 0.25 0.1mol/L 磷酸缓冲液 (ml) 相当于丙酮酸实际量 （ μ mol ） 0.10 0 0.10 0.10 0.10 0.20 0.10 0.30 0.10 0.40 0.10 0.50 各管混匀后 2,4 一二硝基苯肼溶液 （ ml ） 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 各管混匀后，置于 37 ℃ 水浴中保温 20min 。 0.4 mol/L NaOH 溶液 （ ml ） 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 混匀， 10min 后， 30min 内在 520nm 处比色。以第 1 管调零，读取各管吸光度值。 2 标准曲线的制备 取 6 支试管，编号，按下表 3-12 步骤操作： 表 3-12 16 试管编号 1 2 3 4 5 6 吸光度（ A ） 丙酮酸含量 （ μmol ） 试管编号 对照管 测定管 吸光度 （ A ） 表 2 丙酮酸标准曲线的绘制 表 1 金氏法测定血清谷丙转氨酶活性 原始数据记录 17