免疫学实实验技术.ppt

免渡学实验故术  抗体 定义:指杋体的免疫系统在抗原刺激下,由B淋巴细胞或记忆细胞 增殖分化成的浆细胞所产生的、可与抗原发生特异性结合的免疫球 蛋白 1.诊断:各类血清学检测 .ight chain 抗人球蛋白测试,早孕检 测等 医学应用 治疗:单克隆抗体疗法 (类风湿性关节炎多发性 硬化症等),肿瘤治疔 科研应用:免疫共沉淀、免疫印迹、染色 质免疫共沉淀、免疫荧光技术、ELSA等 COo- CoO  多抗来源 ●动物脾脏有上百万种不同的B淋巴细胞系,具有 不同基因不同的B淋巴细胞合成不同的抗体。当 机体受抗原刺激时,抗原分子上的许多决定簇 分别激活各个具有不同基因的B细胞。被激活的 B细胞分裂增殖形成效应B细胞(浆细胞)和记 忆B细胞,大量的浆细胞克隆合成和分泌大量的 抗体分子分布到血液、体液中,即为多克隆抗 体  多克隆抗体制备 动物选择 兔子( rabbit:最常用于自制抗体,抗体量较多。(新西兰,大耳 小鼠( mouse):可用于自制抗体,但抗体量很少。(BALB/C,昆 明鼠) 大鼠(rat):可用于自制抗体,免疫过程要麻醉动物。( Wistar-大 羊(sh goat):常用于较大批量地生产抗体(商品) 马( horse):常用于大批量生产治疗用抗体(商品)。 ·豚鼠( guInea pig):国外实验室常用。  基本步骤 基础免疫:首次,抗 加强免疫:第2次以后,抗 抗原制备: 原用量大,用佛式完 原量减半,多次,间隔2-4 全佐剂( Complate 周,用佛式不完全佐剂 d adjuvant complate Freund 含矿物油,卡介苗等) djuvand不含卡介苗 取血测效价 放血制备血清 可一次放血(颈动脉) 加强免疫两次或 也可多次取血(耳静脉) 三次以后的第7天取 佐剂的作用机理: 延长抗原的作用时间 促进细胞因子分泌 增强吞噬作用 诱导淋巴细胞分裂、增殖 刺激抗原提呈 影响T细胞“极化  实验方法 新西兰大耳白,2000g(雌雄均可),健康,无病原 基础免疫 0.5m|抗原(含0.25~0.5mg蛋白或10颗粒抗原) 05ml佛式完全佐剂(CFA) 制备抗原-佐剂乳化液 背部、颈部皮下多点注射或腿部肌肉注射 加强免疫 间隔2-4周,可进行多次 0.5ml抗原(蛋白量减半) 0.5ml佛式不完全佐剂(FA 制备抗原-佐剂乳化液 背部、颈部皮下多点注射或腿部肌肉注射  实验方法 ●免疫34次以后从耳静脉取血检测效价 酶联法:1:104以上,能达到1:106 免疫双扩散:1:16以上,能达到1:64 价达的的血备清 也可多次取血(耳静脉)  多抗的特点 ●多抗是单抗的混合物,因此多抗的性质是一个群体综合 的 ●比单抗更容易捕捉抗原。因为含有抗不同表位的抗体, 多种抗体都可与抗原结合。 特异性相对较差:因为由不同性质的抗体组成,只要其 交叉反应的抗体,多抗就有交叉反应,所以多抗更 易有交叉反应。 ●抗体的纯化、标记比单抗难:因为含有各种不同类型、 亚类的抗体,提纯、标记的方法有所差别。同时,血清 中含有的杂蛋白比较多。  什么情况下需要制备单克隆抗体 ●目的蛋白有结构类似物 抗原不纯,无法分开 多抗效果不好(已排除非特异性反应) 希望将抗体用于治疗,研制成药品 希望将抗体用于诊断,研制成诊断试剂  单抗制备原理 如果能选出一个 单细胞经分裂增殖而 势 的案理除细舱合 对一种抗原决 1975年分子生物学家GJF克勒和C米尔斯坦在自然杂交技术的基 建立杂交瘤技术,他们把可在体外培养和大量增殖的小鼠 骨髓瘤细胞与经抗原免疫后的纯系小鼠脾细胞融合,成为杂交细胞 外无限增殖的特 又具有抗体形成细 胞的合成和分泌 抗体的特点。将这种杂交瘤作单个细胞培养, 可形成单细胞系,即单克隆。 利用培养或小鼠腹腔接种的方法,便能得到大量的、高浓度的、非 常均一的抗体,其结构、氨基酸顺序 异性等都是一致的,而 培养过程中,只要没有变异,不同时间所分泌的抗体都能保持同 的结构与机能。