分子杂交的基因芯片.ppt

第四章基因操作中大分子的分离和分析 三、分子杂交 分子杂交:指具有一定同源序列的两条核酸单链(DNA或 RNA),在一定条件下按碱基互补配对原则经过退火 处理,形成异质双链的过程。由于操作方式相似,通 常将检测蛋白质的抗原抗体反应也看作是分子杂交。 作用:用于检测混合样品中特定核酸分子或蛋白质 是否存在,以及其相对分子质量的大小。 分类:根据检测对象的不同可分为 Southern杂交、 Northern杂交、 Western杂交。 Southern杂交 即DNA-DNA杂交分析,检测样品中特定的DNA及其 含量。 Northern杂交: 即RNA-DNA杂交分析。检测样品中是否含有特定 基因的转录产物(mRNA)及其含量。 Western杂交 即利用抗原-抗体反应,检测转移到硝酸纤维素 膜上的特异性蛋白质。 Southern杂交 1975年,英国 Southern创建 1是一种检测DNA分子的一种方法,通过 southern印迹转移将琼脂糖凝胶上的DNA分子转 移到硝酸纤维素滤膜上,然后进行分子杂交,在 滤膜上找到与核酸探针有同源序列的DNA分子 2主要步骤: 草因组DNA 林园组DNA 标准分子量DNA 吸引律一 过 维素滤膜 胶转移杂交技术 1)待测DNA样品的制备、酶切 2)待测DNA样品的电泳分离:琼脂糖凝胶电泳 (3)凝胶中DNA的变性:碱变性 (4) Southern转膜: 硝酸纤维素(NC)膜、尼龙膜 毛细管虹吸印迹法、电转印法、真空转移法 (5)探针的制备 (6) Southern杂交(预杂交、杂交) 预杂交的意义:将滤膜的空白处用鱼精DNA或牛奶蛋白 封闭起来,防止在杂交过程中滤膜本身对探针的吸附 (7)洗膜经过一定的洗涤程序将游离的探针分子除 去 (8)杂交结果的检测 3 Southern印迹转移(转膜) 重物(250-500g) 玻璃板 吸水纸 湿滤纸 硝酸纤维素膜 或尼龙膜 湿滤纸 湿滤纸桥 玻璃容器 转移级冲液(20xSSC)支持平台 毛细管虹吸法 Southern转膜示意图 电极 凝胶支持夹 泳液 凝海滤凝 滤纸 胶绵纸胶龙 电转装置示意图 性液、中和液 滤纸 凝胶 密封膜 尼龙膜 真空室 接真空 真空转移装置示意图 印迹转移( blotting):通过电泳将DNA、RNA或蛋 白质样品进行分离,使不同相对分子质量的的分子 在凝胶上展开,然后将凝胶上的样品通过影印的方 式转移到滤膜上的过程称为印迹