- 1、本文档共26页,可阅读全部内容。
- 2、原创力文档(book118)网站文档一经付费(服务费),不意味着购买了该文档的版权,仅供个人/单位学习、研究之用,不得用于商业用途,未经授权,严禁复制、发行、汇编、翻译或者网络传播等,侵权必究。
- 3、本站所有内容均由合作方或网友上传,本站不对文档的完整性、权威性及其观点立场正确性做任何保证或承诺!文档内容仅供研究参考,付费前请自行鉴别。如您付费,意味着您自己接受本站规则且自行承担风险,本站不退款、不进行额外附加服务;查看《如何避免下载的几个坑》。如果您已付费下载过本站文档,您可以点击 这里二次下载。
- 4、如文档侵犯商业秘密、侵犯著作权、侵犯人身权等,请点击“版权申诉”(推荐),也可以打举报电话:400-050-0827(电话支持时间:9:00-18:30)。
查看更多
聚丙烯酰胺凝胶电泳法; (1) 学习聚丙烯酰胺凝胶电泳原理。
(2) 掌握聚丙烯酰胺凝胶垂直板及圆盘电泳的操作技术。
;聚丙烯酰胺凝胶电泳是以聚丙烯酰胺凝胶为载体的一种区带电泳。该凝胶由丙烯酰胺(Acr)和交联剂N,N—甲叉双丙烯聚酰胺(Bis)聚合而成。聚丙烯酰胺凝胶电泳利用电泳和分子筛的双重作用分离物质。
Acr和Bis单独存在或混合在一起时是稳定的,但在具有自由基团体系时就能聚合。引发自由基团的方法有化学法和光化学法两种。化学法的引发剂是过硫酸胺(Ap),催化剂是四甲基乙二胺(TEMED);光化学法是以光敏感物核黄素来代替过硫酸胺,在紫外光照射下引发自由基团。;聚丙烯酰胺凝胶电泳的凝胶体系有连续和不连续电泳之分。不连续电泳系统由浓缩胶和分离胶两种胶体组成,两种胶体分别由不同的pH 的缓冲液和胶贮液配制而成,形成孔径不同的两种胶体。不连续电泳系统电泳分离过程中包括三种物理效应,即样品的浓缩效应、电泳分离的电荷效应和凝胶的分子筛效应。
本次试验采用不连续电泳系统PAGE,通过三种效应将血清中各蛋白质组分按其分子大小、电荷多少不同进行分离。
;聚丙烯酰胺凝胶电泳有圆盘电泳和垂直板电泳之分,但两者的原理完全相同,只是所用的电泳槽不同。
由于时间问题,本次试验将分两组进行,一组使用圆盘,一组使用垂直板。
;夹心式垂直板电泳槽,圆盘电泳槽,电泳仪,直流稳压电源,玻璃板(13×13),注射器及微量注射器
抽气泵,干燥器,培养皿,玻璃棒,吸量管,烧杯,滴管,玻璃管,薄膜手套,滤纸,日光灯
;制备分离胶、浓缩胶有关试剂:
凝胶缓冲液,分离胶贮存液,0.8%过硫酸铵;
浓缩胶缓冲液,浓缩胶贮存液,40%蔗糖溶液,核黄素。
Tris-甘氨酸电极缓冲液(PH8.3)
已加入溴酚蓝指示剂的血清样品
染色液(氨基黑)
1%琼脂(糖)溶液
脱色液(7%乙酸溶液)由学生自己配制
;一、垂直板聚丙烯酰胺凝胶电泳
1.凝胶的制备:
(1)安装夹心式电泳槽
将长短玻璃板分别插到U形硅橡框的凹形槽中(注意勿用手接触灌胶面的玻璃),在长玻璃板下端与硅胶橡框交界的缝隙内加入已??化的1%琼脂糖且两玻璃板内下端处处有琼脂糖(其目的是封住空隙,凝固后的琼脂中应避免有气泡),琼脂凝固后,将硅胶橡框装入电泳槽内,以对角线的方式将螺丝帽旋紧。; 试剂名称;按上表格配胶,二者抽气后混合均匀,小心不要在溶液中搅出气泡,以免过多接触空气。
迅速用滴管将混合后的分离胶装在二块玻璃板之间至短板上端约3-4cm,并用注射器在起上面加一层水约1mm使凝胶形成时有一水平面,(注意加水时,不要引起胶面的大波动)。
在室温中放置,当两界面出现不同折射率时表明已凝胶,时间大约40 分钟,以出现折射率不同的界面为准,再室温下放置十分钟,使凝胶充分。
将分离胶上层的水倒去,再用滤纸吸去多余的水(注意不要碰破胶面),为下一步做准备。
; 试剂名称;按上表所示配胶,抽气后加核黄素0.5ml,混匀,立即加入到已配制好的分离胶上面至短玻璃板上端约0.5cm,插入加样梳,放于日光灯下10 分钟左右浓缩胶就开始凝胶,30~50分钟左右凝好(凝缩胶变为乳白色为准),凝好后小心拔去加样梳。
;将 Tris—甘氨酸电极缓冲液稀释10 倍后倒入电泳装置的左、右槽中,短玻板一侧要稍微超过玻板,长玻板一侧只要越过电泳丝的高度。
用微量注射器通过缓冲液在每个加样凹槽中加入约5ul的样品。;将样品端(短玻璃的一边)接直流稳压电泳仪的负极,接通冷却水,开始电泳。
开始时电流控制在10mA,待样品进入分离胶时,将电流调至30mA左右。当蓝色染料迁移至距离橡胶框下缘琼脂界面处0.5cm 左右时,电泳完成。
将缓冲液回收至试剂瓶中,还可用1-2 次(注意将正负级的缓冲液分开回收)。
;4.剥胶
将固定螺丝旋松,取出硅橡胶框,将一块玻璃板轻轻剥开,然后用玻璃棒将胶板取下放入培养皿中。
5.固定,染色
在培养皿中倒入氨基黑染色液至覆盖胶板,染色分钟左右,此时染色与固定同时进行。(染色液要回收利用)
6.脱色
用 7%乙酸浸泡数次,直至背景蓝色脱去。
;1.凝胶的制备:
(1)安装圆形玻管
将洗净的玻璃管烘 干后用橡胶玻璃头封 严,放置在一边等待 灌胶。
; (2) 分离胶制备
按垂直板的方案进行配胶
您可能关注的文档
- 胸膜及纵膈介绍.ppt
- 胸片题库大全.ppt
- 胸腔积液PleuralEffusion-胸膜疾病.ppt
- 休闲农业课程教材-阳光海岸活水健康世界.ppt
- 选修1酶的应用.ppt
- 选修2生物科学与社会-合理使用抗生素.ppt
- 眩晕是自觉头晕眼花.ppt
- 学前儿童语言教育第五章学前儿童讲述活动.ppt
- 学前儿童语言学教案课件3语言发生的生物基础和社会实践基础.ppt
- 学习抗生素的临床运用.pptx
- 新的一年工作展望.docx
- 医生年终个人工作的述职报告(3篇).docx
- 2023年消防设施操作员之消防设备中级技能考前冲刺练习题附答案详解.docx
- 2022-2023年环境影响评价工程师之环评技术导则与标准通关练习题包括详细解答.docx
- 2023年中级注册安全工程师之安全生产管理考前冲刺检测卷和答案.docx
- 2023年中级银行从业资格之中级银行管理考前冲刺测试卷提供答案解析.docx
- 2023年公共营养师之二级营养师通关模拟考试试卷附带答案.docx
- 证券分析师之发布证券研究报告业务考前冲刺模拟题库.docx
- 2022-2023年二级建造师之二建建设工程法规及相关知识综合提升测试卷附答案.docx
- 2023年二级建造师之二建机电工程实务通关模拟考试试卷提供答案解析.docx
1亿VIP精品文档
相关文档
最近下载
- 《研学旅行课程设计》课件——学习情境二 研之有义—研学课程整体设计.pptx VIP
- 中交股份工程项目成本管理规范(施工类).doc VIP
- 《研学旅行课程设计》课件——学习情境四 研之有序—研学旅行线路设计.pptx VIP
- 《研学旅行课程设计》课件——体验式学习课程内容设计.pptx VIP
- 部编版六年级语文下册古诗词诵读10首理解性默写及答案.doc
- 2022年农产品食品检验员资格认证试题库及答案.docx
- 国家开放大学《初级经济学》形成性作业2参考答案.pdf
- 家校共育精品课件(共21张精品课件).pptx VIP
- 2023年浙江省教育考试院拟聘用人员笔试参考题库(共500题)答案详解版.docx
- 7 研学旅行课程资源设计《研学旅行课程设计》教学课件.pptx VIP
文档评论(0)