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Western Blot( 免疫印迹法 )实验方法步骤 发布日期 :2008-8-25 热门指数 :4360 Western Blot( 免疫印迹法 ) 主要包括以下 4 个基本步骤： 样品制备 电泳分离 蛋白的膜转移 免疫杂交与显色 ―― 蛋白检测溶液和试剂 1X 磷酸盐缓冲液 (PBS) n Modified RIPA buffer Tris-HCl: 50 mM, pH 7.4 ; NP-40: 1% ;Na-deoxycholate: 0.25% ;NaCl: 150 mM ;EDTA: 1 mM ;P MSF: 1 mM ;Aprotinin, leupeptin, pepstatin: 1 microgram/ml each ;Na3VO4: 1 mM ;NaF: 1 mM n 1X SDS 样品缓冲液 62.5 mM Tris-HCl (pH 6.8 于 25°C), 2% w/v SDS, 10% 甘油 ,50 mM DTT, 0.01% w/v 溴酚蓝 转移缓冲液 25 mM Tris base, 0.2 M 甘氨酸 , 20% 甲醇 (pH 8.3) n 10X Tris 缓冲盐 (TBS) 准备 1L 10X TBS: 24.2 g Tris base, 80 g NaCl; 用 1N HCl 调 pH 为 7.6 脱脂奶粉或 BSA n 甲醇 n TBS/T 缓冲液 1X TBS, 0.1% Tween-20 n 封闭缓冲液（ TBS/T ） 1X TBS, 0.1% Tween-20 加 5% w/v 脱脂奶粉或 BSA 一抗的稀释 1X TBS, 0.1% Tween-20 加 5% BSA (多抗 )或 5% 脱脂奶粉 (单抗 ) Note: 一般来说 , BSA 被推荐用于多克隆抗体，脱脂奶粉用于单克隆抗体，这样可得到较高的信噪比。抗体的稀释度参考抗体说明书或根据实验确定。 预染的蛋白质 Marker ，可用于监测转膜的效率样品制备 原始样品可为细胞、组织、培养上清、免疫沉淀或亲和纯化的蛋白，以下为定性检测目的蛋白时细胞样品的处理方法，其余的样品制备方法参阅相关文献。 ．培养细胞或药物处理。 ．弃培养基，用 1X PBS 漂洗细胞 2 次，去尽残留培养基。 3 ．加入 1X SDS 样品缓冲液 (6-well plate, 100 μl /w 或 75 cm 2 移到 Ep 管。注意： 冰上操作。  plate, 500-1000  μl/ 瓶 )，刮落细胞，转 4 ．超声 10~15 秒剪切 DNA 以减低样品粘性。 5 ．煮沸样品 5 minutes 。 6 ．离心 12000g, 5 min ，取上清。 7 ．电泳分离：上样 15μl~20 μl 至 SDS 胶 (10 cm x 10 cm) 电泳。 如要定量检测某蛋白的表达水平，应用 RIPA 裂解液 (1 ml per 10 7 cells/100 mm dish/150 cm 2 flask) 裂 解细胞，收集裂解液至离心管中，在振荡器上混匀 4 ～15min ，14000g 离心 15min （4℃），弃沉淀，用 B radford 法或其它蛋白质测定方法测定上清中蛋白浓度以调整上样体积和上样量， 进行 Western 杂交时还需 设置内或外参照，通常用 beta-actin 。 注意： 一般上样 20~30 μg 已足够，如待检蛋白为低丰度蛋白，可加大上样量至 100μg ，但电泳条带易拖 尾，可制备亚细胞组份或采用更敏感的检测方法。 电泳分离（参照 SDS 电泳方法） 转膜 杂交膜的选择是决定 Western blot 成败的重要环节。应根据杂交方案、被转移蛋白的特性以及分子大小等 因素，选择合适材质、孔径和规格的杂交膜。用于 Western blot 的膜主要有两种：硝酸纤维素膜 (NC) 和 PVDF 膜。NC 膜是蛋白印迹实验的标准固相支持物， 在低离子转移缓冲液的环境下， 大多数带负电荷的蛋 白质会与膜发生疏水作用而高亲和力的结合在一起，但在非离子型的去污剂作用下，结合的蛋白还可以被 洗脱下来。根据被转移的蛋白分子量大小，选择不同孔径的 NC 膜。因为随着膜孔径的不断减小，膜对低 分子量蛋白的结合就越牢固。通常用 0.45 μm 和 0.2 μm 两种规格的 NC 膜。大于 20kD 的蛋白可用 0.45 μ m 的膜，小于 20kD 的蛋白就要用 0.2 μm 的膜了，如用 0.45 μm 的膜就会发生 “ Blowthrough 的”现象。 PVD F 膜灵敏度、分辨率和蛋白亲和力比常规的膜要高，非常适合于低分子