干扰载体构建sop.pdf

shRNA 干扰载体构建 SOP 目录 第一部分 RNA 干扰原理及 shRNA 设计 标准操作规程(SOP) 1. 目的： 了解 RNA 干扰原理，设计 shRNA 干扰序 2. 仪器与设备： 需要能够连接 Internet 的个人计算机，引物设计相关软件(如 Primer Premier 5)。 3. 操作步骤 3.1 RNA 干扰原理 1) RNAi 概述： RNA 干扰（RNA interference, RNAi）是指在进化过程中高度保守的、由双链 RNA （double-stranded RNA，dsRNA ）诱发的、同源 mRNA 高效特异性降解的现象。简单 的说是指一种分子生物学上由双链 RNA 诱发的基因沉默现象。当细胞中导入与内源性 mRNA 编码区同源的双链 RNA 时，该 mRNA 发生降解而导致基因表达沉默，是一种特异 性的转录后基因沉默(post-transcriptional gene silencing)。由于 RNAi 具有高度的序列专一 性和有效的干扰，可以特异地将特定的基因沉默，从而获得基因功能丧失或基因表达量 的降低，因此可以作为功能基因组学的一种强有力的研究工具。RNAi 技术可广泛应用到 包括功能学，药物靶点筛选，细胞信号传导通路分析，疾病治疗等等。 2) RNAi 原理：RNA 干扰包括起始阶段和效应阶段(inititation and effector steps)。在起始阶 段，小分子 RNA 被切割为 21-23 核苷酸长的小分子干扰 RNA 片段(small interfering RNAs, siRNAs) 。证据表明；一个称为 Dicer 的酶，是 RNase III 家族中特异识别双链 RNA 的一员， 它能以一种 ATP 依赖的方式逐步切割由外源导入或者由转基因,病毒感染等各种方式引 入的双链 RNA，形成 19-21bp 的双链 RNAs(siRNAs)，每个片段的 3’端都有 2 个碱基突出。 在 RNAi 效应阶段，siRNA 双链结合一个核酶复合物从而形成所谓 RNA 诱导沉默复合物 （RNA-induced silencing complex, RISC）。激活 RISC 需要一个 ATP 依赖的将小分子 RNA 解 双链的过程。激活的 RISC 通过碱基配对定位到同源 mRNA 转录体上，并在距离 siRNA 3’ 端 12 个碱基的位置切割 mRNA。尽管切割的确切机制尚不明了，但每个 RISC 都包含一 个 siRNA 和一个不同于 Dicer 的 RNA 酶。 3) RNAi 示意图(见图 1) 3.2 shRNA 设计 1) shRNA: 即 short hairpin RNA(短发卡 RNA) ，包含两个短反向重复序 (其中一个与目的基 因互补)，中间由一个 loop 序列分隔，组成发夹结构。shRNA 在体内可以被加工成 siRNA 从而降解目的基因.。示意图见图 2 。 2) shRNA 作用原理：见图 3 。 3) shRNA 设计原则：  克隆到 shRNA 表达载体中的 shRNA 包括两个短反向重复序列，中间由一茎环(loop) 序列分隔的，组成发夹结构，由 polⅢ启动子控制。随后在连上 5-6 个 T 作为 RNA 聚合酶Ⅲ的转录终止子；  两个互补的寡核苷酸两端须带有限制性酶切位点；  StrataGENE 发现 29 个寡核苷酸较之原先推荐的 23 个寡核苷酸可以更有效的抑制目 的基因；  在启动子下游的酶切位点下方紧连一个 C，使插入片段和启动子有一定空间间隔以 确保转录的发生；  shRNA 目的序列的第一个碱基必须是G 以确保 RNA 聚合酶转录。如果选择的目的序 列不以 G 开头，必须在紧连正义链的上游加一个 G ；  ShRNA 插入片段中的茎环应当靠近寡核苷酸的中央。不同大小和核苷酸序列的茎环 都被成功的运用过。其中包含一个独特的限制性酶切位点的茎环利于检测带有 shRNA 插入片段的克隆。在比较了众多不同长度和序列的茎环，5'TCAAGAG3'序 最为有效(AMBION use)；  5-6 个 T 必须放置在 shRNA 插入