杜氏肌营养不良症(DMD)与遗传学习版.ppt

DMD患者：60%基因突变表现为缺失 一般在基因的5’端和中央棒区两个区域 BMD患者：可能缺失了一个或者几个基因序列 dystrophine蛋白的特点 DMD患者体内很少或者没有 BMD患者体内有表达，但是仍然比正常人少 课件 课件 临床治疗 课件 DMD治疗 目前为止尚无治疗DMD的有效方法 药物治疗（对症治疗）：糖皮质激素治疗 短期口服激素治疗可增强骨骼肌力量和功能，并可能在更长时间内稳定骨骼肌力量和功能 基因治疗：利用不直接引起人类疾病，免疫原性较小的腺相关病毒（AAV）为载体，导入人工剪裁的Dys基因 修正肌肉组织(占全身体重40％)的基因缺陷遇到各种各样的困难 康复治疗、矫形治疗、社会心理治疗等 课件 临床检测 课件 产前诊断和杂合子诊断 90%携带者孕妇中产前诊断可能有至少95%的精确度 由于基因突变导致基因的缺失或者多倍体的家庭中，60%-70%可以直接通过southern印迹杂交技术或者PCR技术来测量胎儿的DNA得到 在其余的基因缺失不能明确诊断出来的家庭中，可以通过键的标记来完成产前诊断 与患病男性结婚的女性中 75%的女性：DNA检查、CK血清浓度检查——胎儿是否携带 25%女性难检测： 第一，在病程的一些时期，基因缺陷是无法被检查出来的（可能情况就是等位基因是正常的或者突变的等位基因位于另外一条X染色体上） 第二，一些家庭的一些成员的样本丢失了 第三，两个标记基因之间的基因重组在X染色体传入下一代之前发生了（母系镶嵌） 课件 产前检测 生物化学检查——CK血清浓度 基因诊断 多重PCR Southern blot 探针连接多重扩增(MLPA) 变性高效液相色谱(DHPLC) 抗肌萎缩蛋白的免疫组化 课件 多重PCR方法——DMD、BMD相关基因的缺失、重复 可直接检出DMD／BMD的缺失型突变 65％的患者为基因缺失所致 多重PCR:使用多对引物的 针对DMD基因的缺失热区，利用多对PCR引物在一个PCR管中同时扩增多个外显子，通过和正常对照相比较而判断外显子的缺失情况 课件 多重PCR方法 优点： 1、具有敏感、特异性强和可重复性好的优点 2、需要的DNA量少、操作简单 局限性: 1. 女性携带者——正常x染色体的屏蔽效应，无法检出 2.多重PCR体系内，由于引物之间的相互竞争，有时也会出现个别片段扩增的假阴性结果。（对初次扩增呈阴性结果的片段进行再次扩增，以验证结果的准确性） 课件 Southern blot方法——DMD、BMD相关基因的缺失、重复 是一种常用的DNA定量的分子生物学方法 原理 将待测的DNA样品固定在固相载体(硝酸纤维膜或尼龙膜)上 与同位素标记的核酸探针进行杂交 在与探针有同源序列的固相DNA的位置上显示出杂交信号 通过检测信号的有无、强弱可以对样品定性、定量，从而计算出转入的拷贝数 课件 Southern blot方法 优点：Southern杂交准确性高、特异性强 缺点： 1、不经过靶片段的扩增(PCR)，一般每个电泳通道需要10~30μg的DNA，在实际操作中就需较大量的DNA样品 2、Soutllem杂交不能确定缺失的准确外显子范围，对检测女性重复突变(duplication)或三重重复(triplication)携带者存在困难 3、由于DMD基因很大，需要6到8个cDNA探针，杂交反应才能覆盖整个DMD基因，要1～2周时间用来分析，劳动量大 4、需要使用放射性同位素作为示踪物，会对工作环境带来污染 课件 多重探针连接依赖性扩增技术 MLPA multiplex probe ligation dependent amplification 原理 针对所有需要检测突变的DNA序列，设计多对特异探针 固定在尼龙膜上 和待测样品DNA杂交然后洗膜（正常序列和探针杂交后不被洗脱） 利用连接酶把探针连接起来 使用一套通用引物进行PCR扩增 PCR产物用PCR仪进行分析，DNA片段的缺失／重复以及拷贝数以测序仪得到信号的有无及信号的峰高或面积进行计算 课件 优点： 可以在1个PCR管中完成多达40个外显子的缺失／重复检测 专门用于DMD缺失／重复检测的试剂盒，通过2个PCR反应就可以完成79个外显子及其非翻译序列的缺失／重复突变筛查 灵敏度高、操作简单、可重复性好、经济快捷 课件 DMD患者(A)及其母亲(B)的20-47号外显子的MLPA检测结果 课件 变性高效液相色谱 DHPLC denaturing high performance liquid chromatography 原理 用离子对逆向层析法分离并检测异源双链 通过三乙基醋酸钠（TEAA)作为桥分子，带正电的氨基与核酸分子带负电电荷的磷酸基相互作用，烷基端与色谱柱基质表面的疏水基团相连 不同大小的DN