高效液相色谱仪测定原理及基本构造.ppt

6高效液相色谱仪的测定原理 及基本构造  实验目的 学习高效液相色谱法的测定原理 2.了解并掌握高效液相色谱仪(HP1100) 的基本构造。  实验原理 高效液相色谱法是重要的色谱方法,是在经典 液相色谱法和气相色谱的基础上发展起来的,(经 典液相色谱法使用粗粒多孔固定相,装填在大口径、 长玻璃管柱内,流动相仅靠重力流经色谱柱,溶质 在固定相的传质、扩散速度极其缓慢,柱入口压力 低,仅有低的柱效,分析时间长;气相色谱原类 似,流动相为气体,只能分离小分子量、低沸点的 有机化合物,配合程序升温可分析高沸点的有机化 合物。)弥补了经典液相色谱法和气相色谱的缺点。  它使用了多孔微粒固定相,装填在小口径短的不锈 钢柱内,流动相通过高压输液泵进入高压的色谱柱, 溶质在其中的传质、扩散速度大大加快,从而在短 时间内获得高的分离能力。可分析低 点的有机化合物,更多适用于分析中 高沸点及热稳定性差的有机化合物。由于80%的有 机化合物都可以用高效液相色谱法分析,目前已经 广泛应用于生物工程、制药工业、食品工业、环境 检测、石油化工等行业  根据使用的固定相及流动相的极性不同,分为正 相液相色谱和反相液相色谱:固定相为极性,流动相 为非极性的液相色谱色谱称为正相液相色谱(固定相 为硅胶和氧化镁,流动相为正己烷,醚等);固定相 为非极性,流动相为极性的液相色谱色谱称为反相液 相色谱(固定相为碳粒和氧化铝,流动相为水、醇等) 在液相色谱中,分离有机化合物,一般情况下 用直接与标准物对照的方法,根据保留时间(t0)的 不同进行化合物的定性分析。  当未知峰的保留值与某一已知标准物完全相同 则能判定未知峰可能与已知标准物为同一物质,特 别是如果色谱柱条件改变,未知峰的保留值与已知 标准物的保留值仍能一致,则基本判定是同一物质; 定性分析后,用峰面积进行定量分析。物配成 不同的标准,测定峰面积,作浓度和峰面 曲线,然后据未知物的峰面积,在曲线上求  高效液相色谱法按分离机制的不同分为液固 吸附色谱法、液液分配色谱法(正相与反相 离子交换色谱法、离子对色谱法及分子排阻色谱 法 液固色谱法使用固体吸附剂,被分离 组分在色谱柱上分离原理是根据固定相对组分吸 附力大小不同而分离。分离过程是一个吸附一解 吸附的平衡过程。常用的吸附剂为硅胶或氧化铝 粒度5~10m。适用于分离分子量200-1000的组 分,大多数用于非离子型化合物,离子型化合物 易产生拖尾。常用于分离同分异构体  2.液液色谱法使用将特定的液态 物质涂于担体表面,或化学键合于担体表 面而形成的固定相,分离原理是根据被分 离的组分在流动相和固定相中溶解度不同 而分离。分离过程是一个分配平衡过程。  ●涂布式固定相应具有良好的惰性;流动相 必须预先用固定相饱和,以减少固定相从 担体表面流失;温度的变化和不同批号流 动相的区别常引起柱子的变化;另外在流 动相中存在的固定相也使样品的分离和收 集复杂化。由于涂布式固定相很难避免固 定液流失,现在已很少采用。现在多采用 的是化学键合固定相,如C18、C8、氨基 柱、氰基柱和苯基柱。  液液色谱法按固定相和流动相的极性不同可分为正 柏色谱法(NPC)和反相色谱法(R 正相色谱法采用极性固定相(如聚乙二醇 氬基与基键仓相);流动相为相对非极性的疏水 性溶剂(烷烃类如正已烷、环已 异丙醇、四氢呋嘀、三氯甲烷等以调节组分的保留 时间。常用于分离中等极性和极性较强的化合物 如酚类、胺类、羰基类及氨基酸类 等 反相色谱法一般用非极性固定相(如C18、 C8);流动相为水或缓冲液,常加入甲醇、乙腈 异丙醇、丙酮、四氢呋喃等与水互溶的有机溶剂以 调节保留 用于分离非极性和极 合物。RPC在现 中应用最为 ,据统 计,它占整个HPLC应用的80%左右。