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实验四 观察鞭毛菌的运动、细菌鞭毛染色 13 生物基地 201300140059 刘洋 2014-10-28 同组者：吕赞 刘沛余 马华峥 一、 实验器材 1. 菌种 枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）1~2d 牛肉膏蛋白胨琼脂斜面培养物 铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）1~2d 牛肉膏蛋白胨琼脂斜面培养物 2. 溶液和试剂 0.01%美蓝水溶液、硝酸银染液 AB 液 3. 仪器和其他用品 酒精灯，载玻片，显微镜，双层瓶（内装香柏油和二甲苯），擦镜纸，接种环，小 试管，烧杯，试管架，载玻片夹，滴管，无菌水等 二、 实验目的 1. 学习并掌握鞭毛染色法并了解鞭毛的形态特征。 2. 巩固显微镜操作技术及无菌操作技术。 三、 实验原理 1.菌种压滴法观察活菌运动 鞭毛的功能相当于船的螺浆，在水中可以高速旋转从而推动菌体前行，鞭毛马达还 可以转向（从反时针旋转变为顺时针旋转）从而使菌体发生翻滚进而改变细菌的运动方 向，事实上细菌在游动时也并不是单纯地一直朝前游，而是伴随着不时的随机翻滚转向， 但从表观上看仍表现为细菌的前行。细菌未染色时无色透明，在显微镜下主要靠细菌的 折光率与周围环境的不同来进行观察。鞭毛的细菌运动活泼，且不同时向一个方向运动， 而无鞭毛的细菌则呈不规则布朗运动。这样便可以在光学显微镜下观察到细菌的运动。 2.鞭毛染色 鞭毛是细菌的纤细丝状运动 “器官”。鞭毛的有无、数量及着生方式也是细菌分类 的重要指标。鞭毛直径一般为 10~30mn，只有用电镜才能直接观察到。若要用普通光学 显微镜观察，必须使用鞭毛染色法。首先用媒染剂（如单宁酸或明矾钾）处理，使媒染 剂附着在鞭毛上使其加粗，然后用碱性复红（Gray 氏染色法）、碱性复品红（Leifson 氏染色法）、硝酸银（West 氏染色法）或结晶紫（Difeo 氏染色法）进行染色。 四、 实验步骤 压滴法观察活菌活动 1.涂片 取一块载玻片，在中央滴一滴蒸馏水，用接种环无菌操作从枯草芽孢杆菌（铜绿假 单孢菌)斜面上挑数环菌置于载玻片液滴上，小液滴呈混浊状即可。 2. 染色（可省略） 取一滴 0.01%美蓝溶液滴在小液滴上。 3. 盖片 滴完染色剂后，用镊子夹一洁净的盖玻片，先使其一边接触菌液，然后慢慢地放下 盖玻片，防止产生气泡。（盖片要迅速） 4. 镜检 盖片完成后迅速拿到显微镜下观察，将光线适当调暗，先用低倍镜找到观察部位， 再用高倍镜观察。要区分细菌鞭毛运动和布朗运动，后者只是在原处左右摆动，细 菌细胞间有明显位移者，才能判定为有运动性。（若观察不到，可用油镜） 鞭毛染色（硝酸银染色法） 1. 载玻片准备 将载玻片置于含洗衣粉或洗涤剂的水中煮沸 20min，然后用清水充分洗净，再置于 95%乙醇中浸泡，使用时取出在火焰上烧去乙醇及可能残留的油迹 2. 菌液制备 无菌操作用接种环由普通变形菌 14~18h 牛肉膏蛋白胨半固体新鲜培养物平板上挑 取数环菌落边缘菌体，悬浮于 1~2mL 无菌水中制成轻度浑浊的菌悬液，不能剧烈震 荡。 3. 制片 取一滴菌悬液滴到洁净载玻片一端，倾斜玻片，使菌悬液缓慢流向另一端，用吸水 纸吸去多余菌悬液，自然干燥。 4. 染色 滴加硝酸银染液 A 液覆盖菌面 3~5min 后用蒸馏水充分洗去 A 液。用硝酸银染液 B 液洗去残留水分后，再滴加 B 液覆盖菌面数秒至 1min，其间可用微火加热，当菌面 出现明显褐色时，立即用蒸馏水冲洗，自然干燥。 5. 镜检 用油镜镜检检查。 五、 注意事项 1. 选用活跃生长期菌种进行鞭毛染色，老龄菌鞭毛易脱落。 2. 载玻片必须清洁、光滑、无油迹，否则菌液不能散开，造成菌体堆积，