生物制品生产技术 生物制品生产技术 项目四 病毒性生物制品的制造技术.doc

项目四 病毒性生物制品的制造技术 [内容提要]病毒培养的方法有动物培养、禽胚培养和细胞培养。利用动物接种病毒，应注意动物接种后的饲养管理，掌握收获病毒时间和方法；利用禽胚培养病毒，主要掌握禽胚的选择、病毒的禽胚接种方法及影响禽胚培养病毒的因素；利用细胞培养病毒，应学会细胞培养技术及病毒培养技术。病毒性生物制品生产的主要设备的类型、结构、工作原理、使用方法及注意事项，生物制品企业污物的处理方法。病毒性疫苗的制备技术。概述了生物制品质量检验的基本要点。介绍了几种病毒病常用疫苗和诊断制剂的制备要点、质量标准、保存与使用方法。 任务1 病毒增殖技术 一、病毒的复制、增殖与营养 （一）病毒的复制周期 病毒是专性细胞的内寄生物，自身无完整的酶系统，不能进行独立的物质代谢，必须在活的宿主细胞内才能生活、复制和增殖。病毒的复制增殖过程，大致包括吸附、进入、脱壳、生物合成、装配和释放6个步骤。 图3-1 病毒的复制周期的特征 1、吸附 病毒与细胞首先以非特异性的静电引力相结合，然后不可逆地与动物细胞膜上存在的病毒受体结合。病毒受体决定特异动物病毒的感染范围，非易感细胞不存在这种受体，故不能吸附病毒。细胞膜受体有脂蛋白受体和黏蛋白受体两种，除具有病毒吸附部位外，尚有促进病毒感染的作用。当病毒和易感细胞存在于液体介质中时，病毒即被细胞吸附。吸附过程受多种因素影响。病毒在37℃环境中吸附最佳，在4℃环境中吸附较差。病毒吸附时间由数分钟到数十分钟不等。通常，阳离子存在下病毒吸附能正常进行；强阴离子存在下病毒吸附缓慢乃至受抑制。 2、侵入 侵入与吸附是一个连续的过程，但侵入需要能量。目前发现病毒侵入细胞有3种方式即病毒直接转入胞浆、细胞吞饮病毒、病毒囊膜与细胞融合。无囊膜病毒以前两种方式侵入，有囊膜病毒常以第三种方式进入。病毒进入细胞的速度与温度有关，如用猪肾细胞培养口蹄疫病毒，37℃吸附3min即有90％病毒进入细胞内，但在25℃则需20min，15℃以下时就很少能进入细胞。 3、脱壳 囊膜病毒的脱壳过程包括脱膜和脱衣壳、囊膜脂质与细胞膜融合、裸露的病毒体进入细胞浆内及衣壳被溶酶体消化裂解并释放出核心中的核酸等。无囊膜病毒仅有脱壳过程。但如疱疹病毒则可能在细胞表面脱去囊膜，而痘病毒则在吞饮泡内脱去囊膜。病毒衣壳的脱落和核酸的逸出，主要在胞浆或胞核内完成。病毒脱囊膜主要由细胞水解酶完成，脱衣壳由细胞脱壳酶完成，但酶的形成和特异性受病毒遗传信息制约。 4、生物合成 进入细胞的病毒核酸在细胞浆和细胞核内进行自身的复制并合成蛋白质，该过程依赖细胞提供的能量、病毒所需的前体成分和酶等。在此期间，细胞内尚无完整的病毒粒子，病毒的生物合成过程分早期和晚期两个阶段：早期主要是由核酸（DNA或RNA）通过mRNA合成酶类蛋白质代谢工具和核酸基因组需要的核苷酸原料；晚期主要是通过晚期mRNA合成病毒结构蛋白质。 5、装配 合成的核酸和蛋白质在原部位或转移至胞浆内盘卷和浓聚，然后由宿主细胞浆释出的多肽移向病毒核酸聚集处，并互相联结形成包壳。有的病毒则将壳微粒亚单位在核酸分子表面构成特定的衣壳或核衣壳，从而组成完整的病毒粒子。囊膜病毒，则由细胞膜获得的脂质和糖类及病毒介导蛋白质在病毒衣壳或核衣壳外形成包膜。病毒核酸复制和蛋白质合成度甚快，但装配效率不高，常有—半核酸和蛋白质不能装配成病毒粒子，但仍可排出细胞外，或成为无感染性的空病毒（空衣壳）。多数DNA病毒在细胞核内合成装配，RNA病毒在细胞浆内合成装配。 6、释放 成熟的病毒粒子自细胞释放的方式不一。有的病毒先聚积在细胞空泡内，然后通过细胞通道向外溢出；有的依靠细胞膨胀破裂放出；有的则因细胞感染病毒后死亡裂解或自溶而释出。有囊膜的病毒多数借出芽而穿出细胞游离。然而，无论病毒进入或出芽离开细胞所造成的细胞膜损伤并不会引起细胞死亡。活的细胞易于修补，仍能继续增殖病毒，而细胞自身也能分裂繁殖。病毒在活细胞内复制增殖的速度随病毒种类、细胞种类、形成部位和平衡条件等因素而不同。痘病毒增殖全过程约24～28h，披膜病毒约12h；动物病毒在1个细胞的增殖量约数千个到百万个。 通常，病毒吸附进入细胞后，有2～12h的隐蔽期，该期内病毒感染相关病毒不能被检出。接着病毒粒子逐渐成熟，随着细胞膜破裂，无囊膜病毒被释放，有囊膜病毒则通过胞浆膜出芽成熟。 （二）病毒的生长曲线 将适量的病毒接种于标准培养的高浓度敏感细胞，待病毒吸附后，除去未吸附的病毒，然后继续培养并定时取样测定培养物中的病毒效价，并以感染时间为横坐标，病毒效价为纵坐标，绘制出病毒特征性的繁殖曲线，即一步生长曲线。了解不同病毒的增殖规律，获得