高效液相色谱-金叶教学内容.ppt

高效液相色谱-金叶;背景;色谱法的基本原理;;色谱的基本概念;色谱法的分类;什么是气相色谱法？;什么是液相色谱法？; 高效液相色谱法 （High Performance Liquid Chromatography \ HPLC） 是色谱法的一个重要分支，以液体为流动相，采用高压输液系统，将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，在柱内各成分被分离后，进入检测器进行检测，从而实现对试样的分析。 ;高效液相色谱对于挥发性低、热稳定性差、分子量大的高分子化合物以及离子型化合物的分离尤为有利。如氨基酸、多肽、蛋白质、生物碱、核酸、甾体、类脂、维生素、抗菌素等均可进行分离分析定量。;“三高一广一快”;“三高一广一快”; 局限性： 使用多种溶剂作为流动相，成本高于气相色谱法，且易引起环境污染，梯度洗脱操作复杂； “柱外效应” ：在从进样到检测器之间，除了柱子以外的任何死空间（进样器、柱接头、连接管和检测池等）中，如果流动相的流型有变化，被分离物质的任何扩散和滞留都会显著地导致色谱峰的加宽，柱效率降低； 高效液相色谱检测器的灵敏度不及气相色谱； 不能代替中、低压柱色谱法，在200KPa至1MPa柱压下去分析受压易分解、变性的具有生物活性的生化样品。 ;HPLC与经典LC区别;;输液泵 多用柱塞往复泵，柱塞向前运动，液体输出，流向色谱柱；向后运动，将贮液瓶中液体吸入缸体。如此往复运动，将流动相 源源不断地输送到色谱柱中。 柱塞往复泵属于恒流泵，流量不受柱阻影响，泵压最高为400kg/cm2。 这种泵具有清洗容易，更换流动相方便等优点，但脉动性较大是其缺点。目前多采用双泵补偿法来克服这一问题。;;;避免使用对不锈钢有腐蚀性的溶剂。 例：硝酸、硫酸、盐酸、卤化物， 四氯化碳与异丙醇或四氢呋喃的混 合物，含强络合剂的溶液等。;进样阀;;检测器 紫外检测器 可变波长检测器 光电二极管阵列检测器 荧光检测器 电化学检测器 蒸发光散射 示差检测器 质谱;紫外吸收检测器;检测原理： 朗伯－比尔 (Lambert-Beer) 定律，响应信号（吸光度）与浓度成正比A=lg(1/T)=Kbc 特点： 灵敏度较??（10-6-10-9 g/ml），噪音低，线性范围宽，稳定性好，适于梯度洗脱，不破坏样品，应用广（如蛋白质、核酸、氨基酸、核苷酸、多肽、激素等均可使用 ） 局限： 只能检测有紫外吸收的物质，流动相的截止波长应小于检测波长 专属型、浓度型检测器 ;蒸发光散射检测器;质谱检测器; 示差折光检测器 凡具有与流动相折光率不同的样品组分，均可使用示差折光检测器检测 糖类化合物的检测大多使用此检测系统 这一系统通用性强、操作简单，但灵敏度低（检测下限为10-7g／ml） 流动相的变化会引起折光率的变化，因此，它既不适用于痕量分析，也不适用于梯度洗脱样品的检测 ;荧光检测器 凡具有荧光的物质，在一定条件下，其发射光的荧光强度与物质的浓度成正比 只适用于具有荧光的有机化合物（如多环芳烃、氨基酸、胺类、维生素和某些蛋白质等）的测定 柱前或柱后衍生 其灵敏度很高（检测下限为10-12～10-14g／ml） 痕量分析和梯度洗脱样品的检测均可采用 ;UV-VIS;HPLC的分类;;一、液—固吸附色谱法;1．分离原理;达平衡时,有 ;2．固定相;3.流动相;二、液—液分配色谱法;1.固定相;（2）化学键合固定相：它是将各种不同有机基团通过化学反应键合到载体表面的一种方法。 它代替了固定液的机械涂渍，因此它的产生对液相色谱法迅速发展起着重大作用，可以认为它的出现是液相色谱法的一个重大突破。它是目前应用最广泛的一种固定相。 据统计，约有3/4以上的分离问题是在化学键合固定相上进行的。;2．流动相;优点：色谱柱再生方便，样品负载量大，重现性好，分离效果好等 缺点：尽管流动相与固定相的极性要求完全不同，但固定液在流动相中仍有微量溶解；流动相通过色谱柱时的机械冲击力，造成固定液流失。上世纪70年代末发展的化学键合固定相可克服上述缺点。现在应用很广泛（70~80%）。 ;化学键合相色谱;正相键合相色谱 流动相的极性小于固定液的极性 分离机制：分配：把有机键合层作为一个液膜看待，溶质在两相的溶解 吸附：溶质分子与固定相之间定向作用力、诱导力或氢作用力 固定相：极性大的氰基或氨基键合相 流动相：相对极性小的疏水性溶剂（烷烃类如正己烷、环己烷），常加入乙醇、异丙醇、四氢呋喃、二氯甲烷等以调节组分的保留时间 ;正相键合相色谱 出柱顺序：结构相近组分，极性小的组分先出柱极性大的组分后出柱 适用范围：中