引物保护碱基列表--.docx

11月 13日 引物合成的详解 需要什么级别的引物？ 答：引物常用的纯化方式 C18脱盐， OPC纯化， PAGE纯化， HPLC纯化。 根据实验需要，确定订购引物的纯度级别。 应用 引物长度要求 纯度级别要求 一般 PCR 扩增 <45 base OPC 一般 PCR 扩增 >45 base PAGE 诊断 PCR 扩增 < 40base OPC, PAGE DNA 测序 20base 左右 OPC 亚克隆，点突变等 根据实验要求定 OPC, PAGE ， HPLC 基因构建（全基因合成） 根据实验要求定 PAGE 反义核酸 根据实验要求定 PAGE 修饰引物 根据实验要求定 PAGE, HPLC 如何计算引物的浓度？ 答：引物保存在高浓度的状况下比较稳定。 引物一般配制成 10-50pmol/ul 。 一般情况下，建议将引物的浓度配制成 50pmol/ul ， 加水的体积（微升）按下列方式计算： V ( 微升 )= OD数*（乘） 33 *（乘） （乘） 20000 / ( 除) 引物的分子量。 引物的分子量可以从合成报告单上获得。如果需要配制成其他浓度，按上述公式换算。 注意： 1 OD260= 33 ug/ml. 如何计算引物的 Tm值？ 答：引物设计软件都可以给出 Tm，与引物长度、碱基组成、引物使用缓冲的离子强度有关。 长度为 25mer 以下 的引物， Tm计算公式为： Tm= 4℃(G + C)+ 2 ℃(A + T) 对于更长的寡聚核苷酸， Tm计算公式为： Tm = 81.5 + 16.6 x Log10[Na+] + 0.41 (%GC) – 600/size 公式中， Size = 引物长度。 如何溶解引物？ 答：干燥后的引物质地非常疏松，开盖前最好离心一下，或管垂直向上 在桌面上敲敲， 将引物粉末收集到管底。 根据计算出的体积 加入去离子无菌水或 10mMTris pH7.5 缓冲液，室温放置几分钟，振荡助溶，离心将溶液收集到管底。 溶解引物用的水一般不要用蒸馏水， 因为有些蒸馏水的 pH值比较低（ pH4-5）, 引物在这种条件下不稳定。 如何保存引物？ 答：引物合成后，经过一系列处理和纯化步骤， 旋转干燥而成片状物质。 引物在溶解前，室温状态下可以长期保存。溶解后的引物 -20 度可以长期保存。如果对实验的重复性要求较高，合成的 OD数较大，建议分装，避免反复冻融。修饰荧光引物需要避光保存。 合成的引物 5’端是否有磷酸化 答：合成的引物 5’为羟基，没有磷酸基团。如果需要您可以用多核苷 酸激酶进行 5′端磷酸化，或者要求引物合成公司合成时直接在 5′或 3′端进行磷酸化，需要另外收费。 引物片段退火后不能连接到载体上是什么问题？ 连接反应需要引物的 5’磷酸基团。如果需要将合成的引物退火直接连 接相应的载体上， 引物需要磷酸化。磷酸化的产物如果还不能连接载体 上，需要检查载体的酶切效果，需要改善引物退火的条件。 SiRNA分子具有特殊的对称结构，退火的难度较大，退火时需要提高退火温度。 长链引物为什么出错的几率非常高？ 答：引物合成时， 每一步反应效率都不能达到 100%，产生碱基插入、 缺失、置换突变的因素客观条件都有一直存在。引物链越长，突变的频率 累加起来就越高。 研究人员总希望合成的引物万无一失，这种心情可以理解。但是犹如 PCR扩增，不可能绝对保证扩增产物中没有突变，引物合成也不可能保证 100%正确。要知道，引物合成中发生错误 （非人为因素）的频率，比任何高保真高温聚合酶 PCR扩增过程所产生的频率都要高。做引物合成，长链引物合成，您要有引物中部分引物可能有突变的思想准备。 TaqMan 探针设计的基本原则是什么？答：下列原则供您参考。 ◆TaqMan 探针位置尽可能靠近扩增引物（扩增产物 50-150bp ），但不能与引物重叠。 ◆长度一般为 18-40mer 。 ◆G-C 含量控制在 40-80%左右。 ◆避免连续相同碱基的出现，特别是要避免 GGGG或更多 G出现。 ◆在引物的 5’端避免使用 G。 ◆选用比较多的碱基 C。 ◆退火温度 Tm控制在 68-70C 左右。 有用的荧光染料参数 Name 吸收波长 发射波长 colors 6-FAM （6-carboxy-fluorescein ） 494nm 518nm Green TET （ 5-tetrachloro-fluorescein ） 521nm 538nm Orange HEX （5-hexachloro-fluorescein ） 535nm 553nm Pink TAMRA （tetramethyl-6-carboxyrhodamine ） 5 60nm 582nm Rose RO