哺乳动物组织基因组dna提取模板.ppt

2018/12/6 1 Genomic DNA Extraction from Mammal Tissue 哺乳动物组织基因组 DNA 提取 2018/12/6 2 一、 实验目的 (Experimental Purpose) After the experiment is finished, students should be able to extract genomic DNA from mammal tissue, and to run an agarose gel. 1. 掌握动物基因组 DNA 提取的操作方法。 2. 掌握琼脂糖凝胶电泳的操作的方法。 2018/12/6 3 二、 实验原理 (Experimental Principle) ? The detergents SDS ( sodium dodecyl sulfate) is added to denature proteins and solubilize lipids in membranes leading to cell lysis . The cell lysate is often treated with enzymes that hydrolyze RNA and proteins. 本实验利用去垢剂 SDS( 十二烷基磺酸钠 ) 是为了 使蛋白变性并溶解细胞膜中的脂质从而导致细胞裂解， 而细胞裂解物又常用蛋白酶 K 进行水解处理。 2018/12/6 4 真核生物染 色体 DNA 组 装不同层次 的结构 2018/12/6 5 ? Then they are treated with phenol and chloroform to remove the remaining proteins, which will either enter the organic phase or, if they had denatured, appear at the interphase. Alcohol help to concentrate the DNA while removing nucleotides, amino acids, oligonucleotides and peptides. 随后用酚︰氯仿进行抽提，以去除残留的蛋白质， 这时蛋白质将进入有机相，或者假如己变性的话将呈现 在有机相与水相之间。乙醇沉淀处理则可以浓缩 DNA ， 同时去除核苷酸、氨基酸以及低分子量的寡核苷酸和肽。 2018/12/6 6 ? We can add the eathylene diamine tetraacetic acid (EDTA) to keep the integrity of DNA . EDTA can chelate Mg 2+ and reduce deoxyribonuclease (DNase) activity, because these enzymes require Mg 2+ to work. 为了进一步保护 DNA 样 品的完整性，通常需要在缓 冲 液 中 添 加 乙 二 胺 四 乙 酸 (EDTA) 以整合 Mg 2+ ，这样 将 会 减 少 脱 氧 核 糖 核 酸 酶 (DNase) 的活性，因为该酶 必须在有 Mg 2+ 存在时才会起 作用。 2018/12/6 7 本实验方法分离得到的染色体 DNA 长度为 100- 150kb ，适用于构建基因组文库和 Southern 杂交分析。 如果要求得到较大分子量的 DNA ，则必须省略其中的 振荡步骤。 2018/12/6 8 核酸的分离纯化、测定及 研究方法 一、 分离核酸的一般原则 因为遗传信息全部贮存在核 酸的一级结构中，故完整的一级 结构是保证核酸结构与功能研究 的基础。 2018/12/6 9 （一）核酸的分离和纯化时应遵循两个原则 ① 保证核酸一级结构的完整性； ② 排除其它分子的污染。 （二）核酸的纯度要求 ① 核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度 的金属离子； ② 其它生物大分子如蛋白质、多糖和脂类分子的污染应降低到 最低程度； ③ 排除其它核酸分子的污染，如提取 DNA 分子时，应去除 RNA ， 反之亦然 。 2018/12/6 10 （三）核酸分离纯化的注意事项 ? 为保证分离核酸的完整性和纯度，在实验中应注意： ? ① 尽量简化操作步骤，缩短提取过程，以减少各种有害因素对核酸的 破坏； ? ② 减少化学物质对核酸的降解，为避免过酸、过碱对核酸链中磷酸二 酯键的破坏，操作多在 pH4 ～ 10 条件下进行； ? ③ 防止核酸的生物降解。细胞内或外来的各种核酸酶水解核酸链中的 磷酸二酯键，直接破坏核酸的一级结构。其