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现代实验动物学技术 一、转基因动物 ? 转基因动物是动物基因工程在医学生物学研究 中的突出成果。 ? 近十年来，为分子遗传学、发育生物学、医学 遗传学、肿瘤研究及优良经济动物的开发研究 等多方面做出了很大的贡献。 （一）转基因动物的概念 转基因动物（ transgenic animal ）是指以实验方法导入的 外源基因在其染色体基因组内稳定整合并能遗传给后代的一类 动物。 ? 外源基因随细胞分裂分配到所有子细胞中并遗传给后代，这种 动物叫转基因动物。 ? 严格说，转基因动物有别于嵌合体。 ? 嵌合体动物（ chimeric animal ）：只有部分组织细胞的基因组 中整合有外源基因。 逆转录病毒感染法、胚胎干细胞介导法制 备的动物第一代均为嵌合体。雄原核显微注射法制备的动物第 一代中 1-10% 为嵌合体（延迟整合）。 ? Gordon 等人首次成功地将含有 HSV 和 SV40DNA 片段 的重组质粒 DNA 以显微注射法导入小鼠受精卵的雄原 核内，得到了带有这种外源 DNA 顺序 TGM 。 ? 1982 年 Palmiter 等运用此法得到的所谓“超级巨鼠” , 曾引起整个生物学界的轰动。 ? 到目前为止，人类已获得转基因鱼、鼠、羊、猪、兔、 牛等等大小动物。 ? 从转基因动物所获得的资料几乎涉及医学遗传、肿瘤 学、免疫学等的基因研究，还涉及生物药物的研究， 基因治疗的开发研究等。 （二）转基因动物的制作方法 1 、受精卵雄原核显微注射法 2 、胚胎干细胞（ ES 细胞）法 3 、逆转录病毒感染法 4 、体细胞核移植法 5 、精子载体法 6 、 YAC 法 1 、雄原核显微注射法 ? 以单细胞受精卵为靶细胞，利用显微注射技术 将构建好的载体 DNA 直接注射入受精卵的原核， 再将接受注射的受精卵移入假孕母体输卵管继 续发育获得转基因动物个体。 ? 目前应用较广泛，最早最经典的方法。 这一方法的实验程序如下： （ 1 ）准备假孕母鼠（养母） （ 2 ）受精卵的准备 （ 3 ）基因导入 （ 4 ）胚胎移植 （ 5 ）对幼鼠的鉴定 Timing of Pre-Implantation events Oviduct Transfers Expression of Exogenous Genes Screening Strategies ? Southerns, ? Induction/Loss of Restriction sites, ? PCR ? RT-PCR ? 测定表达产物活性： ELISA ， RIA ? 其成功率的高低主要取决于受精卵和胚胎发育的时 间。 ? 基因的整合是随机的，多数插入单一染色体位点中。 外源基因的插入会引起宿主基因的 DNA 序列重排， 缺失，重复或易位。 ? 外源基因也可不插入呈游离状态，以质粒形式存在 表达功能并传给子代，其详细机理现在也不是很清 楚。 优点： ? 外源 DNA 大小基本不受限制（ 1-50kb ）；导入过 程直观； ? 整合率高 缺点： ? 设备昂贵、环节较多 ? 对操作人员有较高的技术要求 ? 低效率（尤其是大家畜） ? 对卵子伤害大，胚胎存活率低 ? 基因整合随机性 ? 转基因沉默 2 、胚胎干细胞（ ES 细胞）法 ? ES 细胞是早期胚胎的内细胞团经过体外培养建立起来的多潜 能细胞系。 ? 将携带有外源基因的 ES 细胞注入到动物的早期胚胎内，可产 生嵌合体及转基因动物。 ? 它本身是二倍体，能在体外培养，具有高度的全能性，可以 形成包括生殖细胞在内的所有组织，并且在不同的培养条件 下表现出不同的功能状态。 在 ES 细胞上的基因操作： 可以通过逆转录病毒感染、脂质体介导、电穿孔、磷酸钙 共沉淀等方法将外源基因导入 ES 细胞。 因此，借用 ES 细胞系可将人们企望的某种不完整的、无功能基 因直接引入到 ES 细胞中，通过细胞增殖、筛选可得到丧失了 某种基因功能的动物后代。 Generating ES Cells Screening ES Cell Clones Retrieval of Blastocysts Injection of ES cells into blastocysts 优点： ? 外源基因整合情况的可控性高。 ? 可预先在细胞水平检测外源基因的拷贝数、定位、表 达的水平及插入的稳定性。 ? 外源基因导入 ES 细胞的方法多样，细胞鉴定及筛选方