酵母双杂交系统.ppt

整理课件 酵母双杂交系统局限性 某些诱饵蛋白具有自身激活性质。 ---------双杂交前删除该部分，但应避免删除相互作用的结构域 某些蛋白在酵母中不稳定表达或不能准确定位到胞核内。在细胞表面发生的相互作用可采用噬菌体显示系统。 双杂交系统分析蛋白间的相互作用定位于细胞核内，而许多蛋白间的相互作用依赖于翻译后加工如糖基化、二硫键形成等， 这些反应在核内无法进行。 整理课件 酵母双杂交系统局限性 有时DNA-BD或AD融合部分不包括相互作用位点，或破坏了融合蛋白的正确折叠。 4. 哺乳动物蛋白之间相互作用有时要求正确的折叠和翻译后修饰，而酵母细胞不能提供这样的环境。这限制了某些细胞外蛋白和细胞膜受体蛋白等的研究 阳性克隆必须进行体外翻译和表达，用抗原表位特异性的抗体进行共定位研究。 双杂交系统的得到的阳性结果一定要通过其它的实验手段来验证。 整理课件 在酵母双杂交的基础上，又发展： 酵母单杂交--用于核酸和文库蛋白之间的研究 酵母三杂交--三种不同蛋白之间的互作研究 酵母的反向杂交--两种蛋白相互作用的结构和位点。 七、反向双杂交系统和三杂交技术 整理课件 (一) 酵母单杂交系统(one-hybrid system) 1993年，由Wang和Reed等相继创立发展出一种研究蛋白质和DNA相互作用的实验体系。 Wang MM, Reed RR. Molecular cloning of the olfactory neuronal transcription factor Olf-1 by genetic selection in yeast. Nature，1993，364(6433):121-126. 文献出处 整理课件 酵母单杂交系统原理 在酵母单杂交系统中，省略了在酵母双杂交系统中采用的BD-X蛋白质杂交体，而用特异的DNA序列取代DNA Gal4结合位点。 该DNA序列在相关生物系统中是重要的蛋白质结合位点。 靶DNA序列特异的结合蛋白(BDPX)与Gal4 P的激活结构域可融合形成融合体，BDPX与其特异DNA结合位点之间通过相互作用可激活作为表型选择性标志的报告基因的表达。 整理课件 酵母单杂交系统原理 理论上，酵母单杂交系统可利用靶DNA序列，捕获具有与该元件特异结合的结构域的蛋白质。 该系统不仅适用于识别转录因子，也适用于研究参与转录抑制和DNA复制过程的蛋白质。 整理课件 待筛选的蛋白Y或BD结构域同AD结构域融合，蛋白Y上游序列或BD与待目的DNA序列结合，导致AD激活了报告基因表达。 整理课件 酵母单杂交系统应用 ①确定已知DNA-蛋白质之间是否存在相互作用。 ②分离编码结合于目的顺式调控元件或其他短DNA结合位点蛋白的新基因。 ③定位已经证实的具有相互作用的DNA结合蛋白的DNA结合结构域以及准确定位与DNA结合的核苷酸序列。 ----研究DNA-蛋白质相互作用 整理课件 (二) 反向酵母双杂交系统（ reverse yeast two-hybrid system ） 1996年，Vidal等人建立了反向酵母双杂交系统 Vidal M, Brachmann RK, Fattaey A, Harlow E, Boeke JD. Reverse two-hybrid and one-hybrid systems to detect dissociation of protein-protein and DNA-protein interactions. Proc Natl Acad Sci USA，1996，93(19):10315-10320. 整理课件 (二) 反向酵母双杂交系统（ reverse yeast two-hybrid system ） 该系统是一项鉴定阻断蛋白间相互作用的技术，核心在于构建一种反向筛选的报告基因。 在这系统中，野生型BD-X/AD-Y间的相互作用激活一种毒性标志作为报告基因，对酵母宿主是毒性或致死性的，即所谓的阴性筛选。 在此情况下BD-X/AD-Y作用的解离赋予酵母一种选择生长优势。 利用这种方法能方便地鉴定作用缺陷等位基因、解离肽或相关的小分子物质。 整理课件 反向双杂交系统基本原理示意图 整理课件 反向双杂交系统基本原理示意图 双杂交产生的相互作用激活Tet阻遏蛋白，从而抑制阳性筛选标志His3的表达，此时野生型相互作用使宿主细胞表现为组氨酸营养缺陷型。 整理课件 反向酵母双杂交系统的应用 用于筛选缺陷等位基因的研究 在稳定、全长及能够形成正确蛋白质折叠的条件下，已有了几种遗传学策略来筛选作用缺陷性等