蛋白单克隆抗体的制备及其应用.docx

分类号 分类号 密级 华中农业大学硕士学位论文 JEv NS2B蛋白单克隆抗体的制备及其应用 Generation and Application of the Monoclonal Antibodies against NS2B Protein of Japanese Encephalitis Virus 研 究 生：董倩 学 号：2012302110134 指导教师：曹胜波教授 指导小组：陈焕春院士 傅振芳教授 专业：预防兽医学 研究方向：动物传染病 获得学位名称：农学硕士 获得学位时间：2015年6月 华中农业大学动科动医学院 二O一五年六月 万方数据 华中农业大学学位论文独创性声明及使用授权书学位论文 华中农业大学学位论文独创性声明及使用授权书 学位论文 否 如需保密，解密时间 年 月 日 是否保密 独创性声明 J一 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得华中农业大学或其他教育机构的学位或证书 而使用过的材料，指导教师对此进行了审定。与我一同工作的同志对本研究所做的任 何贡献均已在论文中做了明确的说明，并表示了谢意。 研究生签名：j跏暂 时间：沙l多年 易月 l 1 日 学位论文使用授权书 本人完全了解华中农业大学关于保存、使用学位论文的规定，即学生必须按照学 校要求提交学位论文的印刷本和电-y-版本；学校有权保存提交论文的印刷版和电子版， 椭张搋． 新签名球彳／ 签名日期：’沙I罗年易月l J日 签名日期：Ⅵl§年易月I 1日 注：请将本表直接装订在学位论文的扉页和目录之间 万方数据 JEV JEV NS2B蛋白单克隆抗体的制备及其应用 目录 摘要 ．．i Abstract ． ． ． ．． ． ． ．． ． ． ． ． ．． ． ． ． ． ． ．． ． ．． ． ． ． ． ．．iii 缩略语表(Abbreviation) 。v 1文献综述 ．1 1．1乙型脑炎的流行病学 一1 1．1．1乙型脑炎的流行与分布 1 1．1．2乙型脑炎的易感群体 2 1．1．3乙型脑炎的传播 2 1．2乙型脑炎病毒的分子生物学特性 ．．3 1．2．1乙型脑炎病毒的形态结构 3 1．2．2乙型脑炎病毒基因组的结构和功能 3 1．2．3乙型脑炎病毒毒株间的变异 5 1．3乙型脑炎的致病机制 ．．5 1．4乙型脑炎的临床表现和病理变化 一6 1．5乙型脑炎的预防与治疗 ．．6 2研究目的与意义 ．8 3实验材料与方法 ．9 3．1实验材料 一9 3．1．1质粒、菌株、细胞系和实验动物 9 3．1．2主要药品、试剂和仪器 9 3．1．3使用的培养基和其配制方法 ．10 3．1．4缓冲液(溶液)和其配制 ．10 3．2实验方法 ．12 3．2．1 JEV NS2B蛋白单克隆抗体的制备 12 3．2．1．1动物免疫 。12 3．2．1．2间接ELISA法检测小鼠的免疫效价 ．12 3．2．1．3 SP2／0骨髓瘤细胞的准备 ．12 3．2．1．4加强免疫 ．．13 万方数据 华中农业大学2015届硕士研究生学位(毕业)论文3．2．1．5免疫脾细胞的准备 华中农业大学2015届硕士研究生学位(毕业)论文 3．2．1．5免疫脾细胞的准备 ．．13 3．2．1．6饲养细胞的准备 一13 3．2．1．7细胞融合 ．．1 3 3．2．1．8阳性杂交瘤细胞的筛选 ．．14 3．2．1．9阳性杂交瘤细胞的亚克隆 ．．14 3．2．1．10单克隆抗体的大量制备 14 3．2．1．11单克隆抗体效价的测定 15 3．2．1．12单克隆抗体的亚型鉴定 15 3．2．1．13单克隆抗体的IFA分析 15 3．2．1．14单克隆抗体的Western blot分析 一15 3．2．1．15单克隆抗体靶抗原表位区域的分析 16 3．2．1．15．1构建原核表达质粒 ．16 3．2．1．1 5．2突变体蛋白的诱导表达 ．1 9 3．2．1．15．3间接ELISA分析单克隆抗体靶抗原表位区域 20 3．2．1．15．4 Western blot分析单克隆抗体靶抗原表位区域 ．20 3．2．2厄V NS2B蛋白在P3株与SAl4．14．2株的表达差异 ～20 3．2．2．1病毒增殖滴度 ．．21 3．2．2．2病毒复制水平 。2l 3．2．2．2．1病毒RNA的提取 ．21 3．2．2．2．2病毒复制水平的差异分析 21 3．2．2．3病毒NS2B蛋白表达水平 22 4结果与分析 23 4．1免疫小鼠血清效价的测定 23 4．2杂交瘤细胞株的筛选 23 4．3单克隆抗体的大量制