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HPLC 流动相的注意事项
流动相的作用
流动相具有运载样品分子的作用。流动相还具有选择性分离的作用。
当固定相一定时,流动相的种类、配比和流动速度都严重影响分离效果。
流动相的种类
液相色谱所用流动相根据分析目的可分为单一或混合流动相。混合流动相还可分为比例固定和比例可变流动相。
梯度洗脱就是使用比例可变流动相。
流动相使用的注意事项
流动相的级别
流动相的处理
—— 过滤和脱气
流动相的置换
流动相的级别 - 水水是最常见的极性溶剂
HPLC 用水的要求:纯化水(重蒸水)
因为不纯物的存在,去离子水的吸光率较高。
纯化水中去除了无机和有机的污染物,因此吸光率降低。
流动相的级别 - 有机试剂采用 “HPLC”级溶剂
溶剂级别
1
、都经过蒸馏和 0.45um
滤膜的过滤 ( 除纤维毛、未溶解的机械颗粒等)。
–HPLC 级
2
、优级纯的纯度比分析纯大
, 但里面含有极微量的防腐剂和抗氧化剂,这些添加剂往往有紫外吸收。
–优级纯
3
、 HPLC 级经过 0.2um 滤膜的过滤 , 且除去有紫外吸收的杂质。
–分析纯
分析纯级和 HPLC 级溶剂的吸光度比较图
流动相的处理 —— 过滤
?使用 0.45um 或更小孔径滤膜过滤,注意滤膜的种类。
?目的:除去溶剂中的微小颗粒,避免堵塞管路和色谱柱,尤其是使用无机盐配制的缓冲液时。
滤膜类型
、聚四氟乙烯滤膜:适用于所有溶剂,酸和盐。
、醋酸纤维滤膜:不适用于有机溶剂,特别适用于水基溶剂。
、尼龙 66 滤膜:适用于绝大多数有机溶剂和水溶液,可以用于强酸,不适用于二甲基甲酰胺。
、再生纤维素滤膜:蛋白吸收低,同样适用于水溶性样品和有机溶剂。
过滤的注意事项
?不同的试剂分别过滤,过滤后再混合。
?注意滤膜的选择,不要混用。
?要现用现处理,尤其是水和缓冲液。
?要注意操作过程中的防尘。
?试样也必须过滤,可用一次性针头式过滤器。
流动相的处理 —— 脱气
?目的:除去流动相中溶解或因混合而产生的气泡。
?使用梯度洗脱时要有在线脱气装置。
?气泡对测定的影响:
、造成压力波动,影响保留时间。
、色谱柱中的气泡会造成峰变形。
、检测池中的气泡会造成基线波动。
脱气的方法
?1 、超声波振荡脱气
?2 、氦气置换清除法
?3 、使用树脂膜的减压脱气法
?应根据实际的使用情况选择合适的脱气方法。单一流动相或配合好的混合流动相可以采用超声振荡脱气,梯度洗脱最好使用在线减压脱气。
氦气置换清除法
使用树脂膜的减压脱气法
流动相的置换
?极性相似的试剂可以直接置换。
?极性不同的试剂,应用中间试剂作过渡。
例如:甲醇置换为正己烷时,可以考虑选择异丙醇作为中间试剂。
?缓冲液的置换应先用水冲洗,再用有机试剂置换水。直接使用有机试剂会造成盐的结晶,堵塞管路和色谱柱。
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