血红蛋白的提取和分离shk.pptx

学习目标 简述蛋白质提取和分离的基本原理，并了解凝胶色谱法、电泳法等分离生物大分子的基本原理。1、主要概念：①凝胶色谱法 ②电泳法 ③缓冲溶液 ④它们在血红蛋白的提取中分别起到什么作用。2.主要原理：①凝胶色谱法分离蛋白质的原理 ②电泳法分离样品的原理 ③缓冲溶液的组成和作用机理3、课题重点：凝胶色谱法的原理和方法 4、课题难点：①样品的预处理 ②色谱柱填料的处理和色谱柱的装填。2003年4月14日宣布人类基因组序列图完成这标志着进入了后基因组和蛋白质组时代。人类基因组：指DNA分子所携带的全部遗传信息。蛋白质组：生物个体表达的蛋白质分子的总和。主要是对蛋白质功能的研究。对蛋白质的研究和应用，首先需要获得纯度较高的蛋白质。如何从复杂的细胞混合物中提取，分离高纯度的蛋白质呢？思考1 分离生物大分子的基本思路是什么？选用一定的物理或化学的方法分离具有不同物理或化学性质的生物大分子。你认为分离蛋白质和分离DNA一样容易吗？思考2 蛋白质的分离和提取的原理是什么？根据蛋白质各种特性的差异，如分子的形状和大小、所带电荷的性质和多少、溶解度和吸附的性质和对其他分子的亲和力等等，可以用来分离不同蛋白质。思考3 人们用鸡的红细胞提取DNA，用人 的红细胞提取血红蛋白的原因是什么？鸡的红细胞具有细胞核，含有DNA，便于进行DNA的提取，人的红细胞无细胞核，结构简单，血红蛋白含量丰富便于提取血红蛋白。凝胶色谱法 提取分离方法凝胶电泳法 分离蛋白质的方法：一、基础知识㈠ 凝胶色谱法（分配色谱法）： 1、凝胶：一些微小多孔的球体（内含许多贯穿的通道，由多糖类化合物构成如葡聚糖、琼脂糖，具多孔的凝胶就叫分子筛） 2、概念：根据被分离的蛋白质相对分子质量的大小，利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用，来进行分离。3、原理：当不同的蛋白质通过凝胶时，（ ）的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程（ ），移动速度（ ），而（ ）的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在（ ）移动，路程（ ），移动速度（ ），相对分子质量不同的蛋白质因此得以分离。相对分子质量较小较长较慢相对分子质量较大凝胶外部较短较快4、具体过程㈡ 缓冲溶液：1、概念：在一定的范围内，能对抗外来少量强酸、强碱或稍加稀释不引起溶液PH发生明显变化的作用叫做缓冲作用，具有缓冲作用的溶液叫做缓冲溶液。 2、作用： 能够抵制（ ）对溶液的（ ）的影响，维持PH基本不变。外界的酸或碱PH值3、缓冲溶液的配制通常由（ ）种缓冲剂溶解于水中配制而成。调节缓冲剂的（ ）就可以制得（ ）使用的缓冲液。1－2使用比例在不同PH范围内 思考：说出人体血液中缓冲对。 NaH2PO4 / Na2HPO4H2CO3 / NaHCO3思考：在整个实验过程中使用的缓冲液是什么？它的目的是什么？使用的是磷酸缓冲液，目的是利用缓冲液模拟细胞内的PH环境，保证血红蛋白的正常结构和功能，便于观察（红色）和材料的科学研究（活性）。㈢电泳：1、概念：指带电粒子在电场作用下发生 迁移的过程。 2、原理：许多重要的生物大分子，如（ ）等都具有 ) 在( )下，这些基团会带上（ ） 。在电场的作用下，这些带电分子会向着与其（ ）移动。电泳利用了待分离样品中各种分子（ ）以及分子本身（ ）、（ ）的不同使带电分子产生不同的（ ），从而实现样品中各种分子的分离。多肽、核酸可解离的基团一定的PH正电或负电所带电荷相反的电极带电性质的差异大小形状迁移速度 3.分类：两种常用的电泳方法:琼脂糖凝胶电泳和聚丙稀酰胺凝胶电泳。聚丙烯酰胺凝胶电泳：（1）聚丙稀酰胺凝胶：是由单体丙烯酰胺和交联剂N,N-甲叉双丙烯酰胺在引发剂(过硫酸铵和催化剂（四甲基已二胺）的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶（2）原理 蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于它所带静电荷的多少以及分子的大小等因素。为了消除静电荷对迁移率的影响可以在凝胶中加入( )。SDS （3）SDS-聚丙稀酰胺凝胶电泳作用机理:SDS能使蛋白质发生完全变性。由几条肽链组成的蛋白质复合体在SDS的作用下会解聚成单条肽链，因此测定的结果只是( )。SDS能与各种蛋白质形成蛋白质—SDS复合物，SDS所带负电荷的量大大超过了蛋白质分子原有电荷量。因而掩盖了不同种蛋