基因工程制药.pptx

基因工程制药第一节 概述第二节 基因工程基本技术与策略第三节 基因药物生产的基本过程第四节 基因工程药物制造实例第一节 概述一、基因工程建立的基础二、基因工程的相关概念及相关酶学三、基因工程技术所生产的药物四、基因工程制药的优点五、基因工程制药所使用的生物技术六、我国基因工程制药的进展七、基因工程制药生产的化学工艺学要求八、基因工程的发展一、基因工程建立的基础（一）、理论方面的三个重要的发现1.生物遗传物质—DNA的发现2. DNA双螺旋结构和半保留复制机理的建立 1953年，沃森(Watson） 和克里克 （Crick） 首次提出了DNA双螺旋结构和半保留复制机理。这一重大发现大大地促进了现代生物科学的发展。3.遗传信息传递方式的确立（二）、技术上三个重要成果1.基因工程的工具酶 1966年，发现DNA连接酶。1970年Smith和Wilcox在流感嗜血杆菌中分离并纯化限制性内切酶 Hind Ш，使DNA分子的切割成为可能。1979年，Bltimore和Temin领导的两个研究小组分别在各自的工作中发现了逆转录酶。2.基因工程载体为了使DNA片段能在宿主细胞中得以扩增，须将其接到一个特定能够进行自我复制的载体分子上。Lederberg开始从事细菌性因子（F因子）研究。20世纪50-60年代，相继发现其他质粒，如抗药性基因（R因子）和大肠杆菌因子（CoE）。这些工作为基因工程载体系统的建立打下基础。3.基因的体外重组技术 1972年，美国斯坦福大学Berg研究小组利用限制性内切酶EcoR I 和T4 DNA连接酶成功地进行了首例体外基因重组实验。1973年，科恩（Cohen）等人用EcoR I内切酶处理大肠杆菌的抗四环素和抗青霉素及磺胺的质粒，并连接成一个新的重组质粒。将这种工程化的质粒转入大肠杆菌，在含有四环素和青霉素的平板中筛选重组菌落。同年，加利福尼亚的博耶（Boyer）也进行了类似的实验。重组子转化的成功标志着基因工程的诞生。 （三）、基因工程的研究内容 基因工程（genetic engineering）是指在基因水平上，采用与工程设计十分类似的方法，按照人类的需要进行设计，然后按设计方案创建出具有某种新的性状的生物新品系，并能使之稳定地遗传给后代。 （一）、基因工程的相关概念 1.克隆与克隆化 克隆指同一副本或拷贝集合。从众多不同的分子群体中分离的某一感兴趣分子，经扩增产生很多相同分子集合，即为分子克隆。 2.DNA克隆 在体外外来遗传物质与载体DNA结合成具自我复制的DNA分子，通过转化或转染宿主细胞、筛选出转化子细胞，再扩增提取获得大量同一DNA分子，即DNA克隆又称重组DNA。二、基因工程相关概念及基本工具3.目的基因 有时应用重组DNA技术的分离、获得某一感兴趣的基因或DNA序列，有时是为获得感兴趣基因的表达产物--蛋白质。4.基因载体 也称克隆载体。这是为“携带”感兴趣的外源DNA、实现外源DNA的无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA分子。其中，为使插入的外源DNA序列可转录、进而翻译成多肽链而设计的克隆载体又称表达载体。可充当克隆载体的DNA分子有质粒DNA、噬菌体DNA和病毒DNA。（二）、基因工程的工具酶 克隆和进行基因操作需要对遗传物质进行剪切、修饰和连接，这些过程都是在工具酶的催化下完成的。按功能将工具酶分类， 可分为剪切酶类、 连接酶类和修饰酶类如下所示分子剪刀和分子针线GCCTAGGGATCCCCTAGGGATCC G1.限制性核酸内切酶 (restriction endonuclease, RE)(1) 定义是一类由细菌产生的能专一识别和切割双链DNA中的特定碱基序列的核酸内切酶，简称限制酶或切割酶。 Bam HⅠ+(2) 分类、作用Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ（基因工程技术中常用Ⅱ型）与甲基化酶共同构成细菌的限制-修饰系统：限制外源DNA，保护自身DNA，稳定细菌遗传性状。(3)命名 属 种 株 序Escherichia coli RY13株大肠杆菌 RY13株的第一种酶EcoRⅠ第一个字母取自产生该酶的细菌属名第一个字母，用大写；第二、第三个字母是该细菌种名的前两个字母，用小写；第四个字母代表菌株类型；如果菌株有几种酶，在代表菌株的字母后用罗马数字表示。(4)Ⅱ类酶识别序列特点—— 回文结构(palindrome) 特异识别及切割4?8个bp长度且具有回文序列的DNA片断，主要产生3种末端结构： 5ˊ－粘性末端 3ˊ－粘性末端 平端或钝端 回文序列(palindrome) 是指该部位的核苷酸序列呈180O反向重复; 粘性末端(sticky end) 是指经内切酶特异切割后产生的5ˊ－末端突出和3ˊ－末端突出的碱基序列相互间具有互补性。GGATCCCCTAGGGTCGACCAGCTGGCCT