试论DNA重组质粒的构建.pptx

DNA重组质粒的构建;基因克隆 gene cloning 应用酶学的方法，在体外将目的基因与载体DNA结合成一具有自我复制能力的DNA分子（重组体），继而通过转化或转染宿主细菌或细胞、筛选出含有目的基因的转化子细菌或细胞，再进行扩增、提取获得大量同一DNA分子拷贝。 核心技术：DNA重组技术 （ recombinant DNA technique ） ;基因克隆的基本程序： 分 — 切 — 接 — 转 — 筛 PCR 酶切 连接 转化转染 抗性或标记筛选 目的基因DNA片段的获得 外源DNA分子与载体DNA分子的体外重组 重组DNA分子转移到适当的受体菌或细胞 重组DNA 分子克隆的筛选和鉴定 目的基因或其表达产物的纯化和鉴定 基因克隆技术的特点： 1. 可在体外人工的, 有目的的, 根据需要进行基因的重组、表达、测序、诱变、修复； 2. 方法简便、快速、准确、特异，能保证研究与开发的需要。;基因克隆示意图;胰岛素 人生长激素 干扰素 白细胞介素2 粒细胞集落刺激因子 粒细胞巨噬细胞集落刺激因子 红细胞生成素 EPO 组织纤溶酶原激活剂 生长激素 促生长素 抗血友病因子Ⅷ 脱氧核糖核酸酶 葡糖脑苷脂酶 鼠单克隆抗体;例： 干扰素是治疗癌症的重要物质，人血液中每升只能提取0.05μg干扰素，因而其价格昂贵。但美国有一家公司用遗传工程方法合成了价格低廉、药性一样的干扰素，其具体做法是： 从人的淋巴细胞中提取能指导干扰素合成的基因，并使之与一种叫做质粒的DNA结合，然后移植到酵母菌内，从而用酵母菌来产生干扰素。 酵母菌能用出芽方式繁殖，速度很快，所以，能在较短的时间内大量生产干扰素。利用这种方法不仅产量高，并且成本也较低。;DNA重组操作过程;重组质粒构建：目的DNA的PCR扩增 DNA片段和载体的酶切 片段DNA与载体的连接 载体： plasmid（primary） 工具酶：限制性内切酶 连接酶 ;常见的基因工程载体;载体的基本结构单元： 1.复制起点 2.克隆位点 3.筛选标记 其他条件： 4.适当大小 5.易于操作：包括宿主、转化（或转染）、分离纯化、重组等等???;质粒(Plasmid);通常质粒含有某些染色体没有的基因，负责编码某些功能蛋白，这些功能并不是细菌生存所必需的，但在一定环境下，可对细菌宿主的生存有利。由质粒产生的表型包括对抗生素的抗性（R因子）、产生抗生素、降解复杂有机化合物、产生大肠杆菌素（大肠杆菌素因子col）、肠毒素及限制酶、修饰酶等。 质粒存在于细菌、放线菌、真菌以及一些动植物细胞中，在细菌细胞中最多。它们复制时利用宿主细胞复制自身染色体的同一组酶系。 ;质粒DNA的特征;;（四）人工构建质粒的基本元件;pBR322 plasmid 是一个克隆载体，作为一个克隆载体最基本的要求都具备： 复制起点:Ori 克隆位点:EcoR I; Hind III;Bam HI; Sal I 筛选标记:Ampr。 ;T-vector PCR产物亚克隆载体; T—Vector是一种高效克隆PCR产物 (TA Cloning) 的专用载体，由pUC18载体改建而成的。在pUC18载体的多克隆位点处的Xba I 和Sal I 识别位点之间插入了EcoR V 识别位点，用EcoR V 进行酶切反应后，再在两侧的3‘端添加“T”而成。因大部分耐热性DNA聚合酶反应时都有在PCR产物的3’末端添加一个“A”的特性,所以用本制品可大大提高PCR产物的连接、克隆效率。 T-vector 克隆PCR产物时用高效连接液Ligation Solution I 可以在极短的时间内 (30分钟～1小时) 完成连接反应，大大地方便了实验操作。 用途 克隆PCR产物。 对克隆后的PCR产物使用M13 primers进行DNA测序。; 原核生物表达载体 Bacterial expression vector;复制起点 克隆位点 筛选标记 启动子﹡ 转录终止序列﹡ 核糖体结和位点：起始密码子ATG和SD序列（翻译识别）; 真核生物表达载体 （mammalian expression vector);真核生物表达载体的结构单元;Location of Features PCMV IE: CMV IE enhancer: 1-659 CMV IE promoter: 669-750