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细菌染色技术 一、细菌的革兰染色法 革兰染色法 (Gram stain) 是细菌学上最经典的、使用最广泛的一种染色方法。由丹麦细菌学 家革兰 (Christian Gram)于 1883 年创立。细菌染色后，不仅可以观察其形态，而且可根据染色结 - 果将细菌分为两大类，即革兰阳性菌 (G+ 菌)和革兰阴性菌 (G 菌) 。 1、原理： + - (1)G 菌细胞壁结构致密 (肽聚糖层厚 )，且脂质含量少，乙醇不易渗入脱色； G 菌细胞壁结 构疏松 (肽聚糖层薄 )，且脂质含量多，乙醇溶解脂质后易渗入细胞而脱色。 (2)G+菌菌体含有大量核糖核酸镁盐，可与碘、结晶紫牢固结合，使已着色的细菌不被乙醇 - 脱色。 G 菌菌体内核糖核酸镁盐含量小，易被乙醇脱色。 + - (3)G 菌等电点比 G 菌低，在同一 pH条件下阳性菌比阴性菌所带阴电荷要多， 故与带正电荷 的碱性染料 (结晶紫 )结合牢固，不易被乙醇脱色。 2、应用 革兰染色法的实际应用意义有三： + - (1)按照革兰染色法可把细菌分为 G 和G 两大类； + - (2)G 菌和 G 菌的致病性不同，所致疾病各异； + - (3)对G 和G 菌，选择不同抗菌物治疗。 3、材料 　 (1)葡萄球菌和大肠埃希菌培养 18～24h 后的混合菌液。 (2)兰染色液：结晶紫染液、碘液、 95%酒精、稀释复红或沙黄染液。 (3)载玻片、接种环、酒精灯、吸水纸、显微镜等。 4 、方法 标本片制备 (1)载玻片准备： 取一张清洁载玻片， 用蜡笔在其背面画出二个有一定间隔、 直径约 1～2cm 的涂抹范围，用数字或符号做好标记。 (2)涂片：将接种环在火焰上烧灼灭菌，冷却后取菌液直接涂布在标记的涂抹范围内。接种 环在火焰上烧灼灭菌。 (3)干燥：涂片最好在室温下自然干燥，或将标本面向上，置于离酒精灯火焰约半尺高处缓 慢烘干，切不可放在火焰上烧干。 (4)固定：将干燥后的涂片用片夹夹住，使涂抹面向上缓慢通过火焰 3 次，然后自然冷却。 固定即可杀死细菌，并使细菌固着于玻片上，以免染色时脱落；又可使细菌蛋白凝固，而易着 色。 革兰染色法： (1)初染：在固定好并冷却了的涂片上滴加结晶紫染液 1～2 滴，作用 1min 后，用细水流从 玻片的一端把游离的染液洗去。 (2)媒染：滴加卢戈 (Lugol) 碘液数滴，作用 1min 后水洗。碘液是媒染剂，使结晶紫染液与 细菌结合更牢固。 (3)脱色：滴加 95%酒精数滴，轻轻晃动玻片， 使玻片上流下的酒精液无紫色为止 (约需 0.5～ 1min) ，流水冲洗。 (4)复染：滴加稀释复红 (或沙黄 )染液数滴，作用 1min 后流水冲洗。最后用吸水纸印干标本 片或自然干燥后，玻片上滴加香柏油，用油镜观察。 5、结果 + - G 菌染成紫色； G 菌染成红色。 6 、影响因素 ⑴操作因素：涂片太厚或太薄，菌体分散不均匀，可影响染色结果。固定时避免菌体过份 受热。脱色时间要根据涂片厚薄灵活掌握。 ⑵细菌因素：不同时间培养物，革兰染色结果有差异，如葡萄球菌幼龄菌染成紫色。而老 龄菌被染成红色。细菌染色时最好用 18～24h 的细菌培养物。